建立檢測血液中EC、KP、SA 和MRSA的多重PCR方法

吳許文，溫旺榮，李沛樟，倪金良，簡仕銘

(1.暨南大學附屬第一醫院檢驗科,廣東廣州 510163；2.鏡湖醫院檢驗科,澳門 999078)

敗血癥是由致病菌引起血流感染的一種常見綜合征，及時作出診斷是降低患者病死率的關鍵[1]。主要是因消化道、呼吸道、傷口感染導致病原體進入血液循環所致[2-6]。澳門鏡湖醫院檢驗科2010-2016年相關數據顯示，近七年從血液中分離的主要致病菌有大腸埃希菌(EC)40.18%，金黃色葡萄球菌(SA)11.87%和肺炎克雷伯菌(KP)9.48%，其中因濫用抗菌藥物而產生的耐甲氧西林SA(MRSA)占SA的53.18%。

致病菌在血液循環內會產生各類毒素，引起寒戰、發熱、休克，甚至死亡。為防止更嚴重的后果,及時、準確地診斷敗血癥至關重要。目前，血液細菌培養是診斷敗血癥的主要方法，但培養和鑒定需5～7 d才能得到結果，耗時過長影響了其應用價值，未能達到快速、有效治療的目的。聚合酶鏈反應(PCR)技術是一種簡單、快速、經濟的分子診斷方法[7]。通過核酸提取、PCR擴增和分析，一般可在數小時內得到結果，具有很大的潛在應用前景。本研究希望通過建立多重PCR方法，對EC、KP、SA和MRSA同時進行檢測，并將16S rDNA作為陽性感染對照組，從而提高準確性、降低成本和縮短時間，達到一次性檢出血液中的主要致病菌的目的。

1 材料及方法

1.1菌株來源 本研究所采用菌株包括EC、KP、SA、MRSA、表皮葡萄球菌(SE)、路鄧葡萄球菌(SL)、鮑曼不動桿菌(AB)、銅綠假單胞菌(PA)、普通變形桿菌(PV)、糞腸球菌(EF)、無乳鏈球菌(SAg)、創傷弧菌(VV)、停乳鏈球菌(SDy)、緩癥鏈球菌(SMi)和頭狀葡萄球菌(SC)均為澳門鏡湖醫院臨床分離菌株。購自美國菌種保藏中心(ATCC)的其他菌株包括EC(ATCC 25922)、KP(ATCC 700603)、SA(ATCC 29213)、MRSA(ATCC 33591)和SE(ATCC 12228)。

1.2培養基與試劑 Mueller-Hinton(M-H)平板、血平板均購自法國生物梅里埃公司，肉湯LB培養基為自配，BACTECTM培養瓶購自美國BD公司。2×Multiplex PCR Kit購自QIAGEN公司，DL2000 DNA標志物、Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR Kit均購自TaKaRa公司，DuRed 核酸染料購自泛博生化公司。其他化學試劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1引物設計 參照文獻[8-9]設計引物，包括細菌16S rDNA基因、EC phoA基因、KP mdh基因、SA femA基因和MRSA mecA基因。引物由深圳華大基因有限公司合成。引物序列和產物大小見表1。

表1 引物序列和產物大小

1.3.2細菌培養及基因組DNA提取 將分純的標準菌株分別接種于LB肉湯，37 ℃培養過夜，取100 μL菌液 13 000×g離心1 min，棄上清液后加入50 μL Takara Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR Kit，并按說明書操作提取DNA，直接用于PCR反應。而血流感染的標本可置于血培養瓶37 ℃培養4 h進行預增菌，然后取500 μL于離心管 13 000×g離心1 min，棄上清液后加入50 μL Takara Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR Kit，并按說明書操作提取DNA，直接用于PCR反應。

1.3.3單一基因PCR擴增 根據所設計的引物，在相同條件下以標準菌EC ATCC 25922、KP ATCC 700603、SA ATCC 29213和MRSA ATCC 33591的DNA為模板，分別對其進行16S rDNA、EC phoA、KP mdh、SA femA和MRSA mecA單一基因PCR擴增。PCR反應體系(25 μL)：2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 12.5 μL、0.1 μmol/L引物、模板(Template)1 μL、雙蒸餾水(ddH2O)至25 μL。經預試驗獲得的PCR反應程序為95 ℃預變性15 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，進行35個循環，72 ℃延伸10 min，PCR產物于4 ℃保存，1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

1.3.4多重PCR條件優化 為建立快速同時檢測多個目標病原體的多重PCR方法，將所有引物加到同一個反應里面，PCR反應體系仍為25 μL，對EC ATCC25922、KP ATCC700603、SA ATCC29213和MRSA ATCC33591的DNA模板進行多重PCR擴增。優化反應條件及體系并進行正交試驗，包括調整引物為0.01～0.20 μmol/L，以0.02 μmol/L遞增；根據設計的引物退火溫度，以56 ℃為基礎，以2 ℃遞加，直至62 ℃，時間90 s，進行35個循環，72 ℃延伸10 min，PCR產物于4 ℃保存，1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

1.3.5多重PCR方法的特異性 采用Takara Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR Kit提取試驗菌株基因組DNA，利用所建立的多重PCR方法進行擴增，驗證本方法的特異性。

1.3.6多重PCR方法的靈敏度 測定EC ATCC 25922、KP ATCC 700603、SA ATCC 29213和MRSA ATCC 33591的菌液濃度并進行10倍梯度稀釋，依次2.75 ×106至2.75 CFU/mL、 2.43×106至2.43 CFU/mL、3.13×106至3.13× CFU/mL和3.03×107至24.3 CFU/mL，各稀釋度經裂解后取1 μL基因組DNA，分別進行多重PCR擴增，以確定其檢測限。

1.3.7驗證試驗 將建立的多重PCR方法與傳統血培養方法對300個血培養樣本進行比較，驗證本方法的可靠性。血培養方法為采集血液標本于BACTECTM全自動血培養系統配套培養瓶，放于BACTEC9240血培養儀37 ℃培養直至儀器提示陽性后轉種血平板過夜，后挑取單菌落到Vitek-2 Compact微生物鑒定分析儀進行藥敏和鑒定試驗，如儀器培養5 d無提示陽性則視為陰性。

1.3.8預增菌試驗 使用標準菌EC ATCC25922配制為1個單位菌液[5]置于BACTECTM培養瓶，37 ℃培養1、2、3、4 h進行預增菌，并按Takara Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR Kit說明書操作提取DNA，直接用于PCR反應。

2 結 果

2.1單一基因PCR檢測結果 以EC ATCC25922、KP ATCC700603、SA ATCC29213和MRSA ATCC33591為模板，使用16S-F/16S-R引物經擴增后PCR產物在1 500 bp有16S rDNA條帶；使用PhoA-F/PhoA-R引物擴增EC ATCC25922后PCR產物為903 bp；使用Mdh-F/Mdh-R引物擴增KP ATCC700603310后PCR產物為364 bp；使用MecA-F/MecA-R引物擴增MRSA ATCC33591后PCR產物為310 bp；使用FemA-F/FemA-R引物擴增SA ATCC29213后PCR產物為132 bp，所有目的擴增條帶均清晰。在該反應體系下的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1。單一基因片段大小與預期結果相符。

2.2多重PCR條件優化 在單一PCR反應體系擴增的基礎上優化了多重PCR反應體系及條件，最佳反應體系(25 μL)為2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 12.5 μL，引物終濃度：16S-F/16S-R為0.06 μmol/L(0.15 μL)、PhoA-F/PhoA-R為0.01 μmol/L(0.25 μL)、Mdh-F/Mdh-R為0.02 μmol/L(0.5 μL)、MecA-F/MecA-R為0.1 μmol/L(0.25 μL)和FemA-F/FemA-R為0.12 μmol/L(0.3 μL)，Template 1 μL、ddH2O 7.5 μL。而在56～62 ℃的退火溫度實驗試驗中，60 ℃擴增效果較好，確定其為最終退火溫度。反應條件為95 ℃預變性15 min后,按94 ℃ 30 s、60 ℃ 1.5 min、72 ℃ 1.5 min進行35個循環,然后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。EC ATCC 25922的PCR產物于1 500、903 bp有條帶，KP ATCC 700603的PCR產物于1 500、364 bp有條帶，SA ATCC 29213的PCR產物于1 500、132 bp有條帶，MRSA ATCC 33591的PCR產物于1 500、310、132 bp有條帶。其多重PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2。

注：M表示DNA Marker DL2000;N表示陰性對照;1為EC ATCC25922;2為KP ATCC700603;3為MRSA ATCC33591;4為SA ATCC29213;5為EC ATCC25922;6為KP ATCC700603;7為MRSA ATCC33591;8為SA ATCC29213

圖1 EC、KP、MRSA、SA單一基因PCR電泳結果

注：M表示DNA Marker DL2000;1為EC ATCC 25922;2為KP ATCC 700603;3為SA ATCC 29213;4為MRSA ATCC 33591;5為EC ATCC 25922、 KP ATCC 700603、SA ATCC 29213和MRSA ATCC 33591

圖2 EC、KP、SA、MRSA多重PCR電泳結果

2.3多重PCR的特異性 EC在16S rDNA和phoA位置有陽性條帶，KP在16S rDNA和mdh位置有陽性條帶，SA在16S rDNA和femA位置有陽性條帶，MRSA在16S rDNA、mecA和femA位置有陽性條帶。其他菌株只有在16S rDNA位置出現陽性條帶。表明本研究所建立的多重PCR方法具有高度特異性，沒有發現假陽性和假陰性結果，特異度為100%。見表2。

表2 多重PCR的特異性

注：+表示陽性；-表示陰性

2.4多重PCR的靈敏度 EC ATCC 25922的phoA基因檢測限為2.75×102CFU/mL，KP ATCC 700603的mdh基因檢測限為2.43×103CFU/mL，SA ATCC 29213的femA基因檢測限為3.13×102CFU/mL，MRSA ATCC 33591的mecA基因檢測限為3.03×102CFU/mL。而16S rDNA的檢測限EC ATCC 25922為27.5 CFU/mL、KP ATCC 700603為2.43×102CFU/mL、SA ATCC 29213為3.13×102CFU/mL和MRSA ATCC 33591為3.03×103CFU/mL。見圖3。

2.5驗證試驗 300份血標本中傳統血培養方法測定陽性標本187份，其中EC為116份，KP為24份，SA(不包括MRSA)為4份，MRSA為6份，其他血液致病菌感染為37份。采用多重PCR方法檢出16S rDNA陽性標本183份，在16S rDNA陽性標本中phoA陽性114份，mdh陽性22份，femA陽性10份，mecA陽性6份，與傳統血培養方法檢測敗血癥感染比較，其準確率為97.9%(183/187)，雖然多重PCR方法出現部分假陰性，但超過95%血流感染可在約8 h檢測到，是一種快速檢測敗血癥的方法。見表3。

注：A表示多重PCR對EC和SA的靈敏度。M為DNA Marker DL2000;1～7為EC ATCC25922，濃度依次為2.75×106、2.75×105、2.75×104、2.75×103、2.75×102、27.5、2.75 CFU/mL;8～14為SA ATCC29213，濃度依次為3.13×106、3.13×105、3.13×104、3.13×103、3.13×102、31.3、3.13 CFU/mL。B表示多重PCR對MRSA和KP的靈敏度。M為DNA Marker DL2000；1～7為MRSA ATCC33591，濃度依次為3.03×107、3.03×106、3.03×105、3.03×104、3.03×103、3.03×102、30.3 CFU/mL;8～14為KP ATCC700603，濃度依次為2.43×106、2.43×105、2.43×104、2.43×103、2.43×102、24.3、2.43 CFU/mL

圖3 多重PCR的靈敏度

續表3 多重PCR方法與血培養方法檢測結果比較(n)

注：-表示陰性

2.6預增菌試驗 16S-F/16S-R引物擴增4 h的PCR產物在1 500 bp有 16S rDNA清晰條帶。見圖4。

注：M表示DNA Marker DL2000;1為1 h;2為2 h;3為3 h;4為4 h

圖4預增菌試驗

2.7多重PCR方法和傳統血培養方法檢測時間比較 多重PCR方法8.3 h可得到結果，而傳統血培養方法則需等待血培養儀器提示陽性后再進行轉種培養和生化鑒定等過程，總時間60 h可得到陽性鑒定結果，培養陰性結果則需要5 d才可確定為陰性。見表4。

表4 多重PCR方法和傳統血培養方法檢測時間比較

注：-表示不需要該步驟

3 討 論

PCR是簡單、實用的分子生物學技術[7]，通過將核酸變性、退火和擴增3個步驟對DNA模板進行復制。該檢測技術與常規培養分離細菌的方法比較，具有快速、經濟等優點，在臨床檢驗方面具有良好的應用前景，市場上已研發出許多用于檢驗臨床致病菌的PCR商品化試劑盒[12-13]，如德國Roche公司的LightCycler SeptiFast MGRADE-test、韓國SeeGene公司的Magicplex Sepsis Real-time PCR等，均可檢測敗血癥患者血液中的EC[2,11]、KP[12]、SA[1，8]、沙門菌和志賀菌等多種微生物，但其儀器、設備要求高，試劑成本昂貴。因此，希望透過建立一個可同時檢測EC、KP、SA和MRSA的多重PCR方法，縮短血流感染所需的檢測時間，以達到盡快查找病因和診治的目的,同時，通過自行研發以降低檢測成本，減輕患者的醫療負擔。

引物是影響PCR擴增成功的重要一環，因此，選取合適的基因或序列作為目的基因設計引物很重要，從相關文獻可知，EC的檢測常會使用到bfp、eae、stx、AggR、Elt、Est和inv目的基因來分類不同的EC菌群[2,11,16]，亦有研究表明，phoA基因可作為EC通用的分子標記[8,17]。

HAEGGMAN等[18]報道了KP管家基因mdh編碼蘋果酸脫氫酶和gyrA基因編碼旋轉酶亞單位A用于評價該菌的遺傳多樣性，其后有學者使用mdh作為目的基因對KP進行了PCR檢測[8,15]。而對SA的檢測，常用nuc，sodA和femA作為種特異性目的基因設計引物[1,14]。隨著臨床抗菌藥物的普及使用和濫用，SA產生抗藥性菌株漸多，其中產生的MRSA除對甲氧西林耐藥外，對氨基糖苷類、大環內酯類等常用抗生素均具有多重耐藥性，可用PCR方法檢測SA的甲氧西林抗性mecA基因，以確定該SA是否為MRSA[10,14]。

本研究選取了THONG等[8]報道的phoA、mdh、femA和mecA為目的基因，建立了可同時檢測血流感染中幾種常見致病菌，包括EC、KP、SA和MRSA的多重PCR方法。另外，除上述目標菌外，在多重PCR體系中同時加入了針對原核生物保守區16S rDNA序列的引物8F/1492R[9]，檢測其他細菌引起的敗血癥，對EC、KP、SA和MRSA以外的細菌感染作出陽性提示，以避免漏檢。

血液具有各種復雜的成分，選取合適的DNA提取方法對血流感染標本進行DNA提取是PCR檢測成功與否的另一影響因素。

BANADA等[1]用白細胞、血漿和全血標本檢測SA引起的敗血癥，結果發現，對不同組分的血液標本中細菌DNA提取的結果具有差異，其中全血標本檢測陽性率最高。因此，本研究亦選擇了用全血標本對血流感染中的細菌DNA進行收集提取；另外，細菌因其種類不同，提取方法的差異也會影響獲得細菌DNA的量，本研究選取日本Takara公司的 Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR Kit對血中各類細菌進行DNA提取，獲得了足夠PCR試驗的DNA量。

而根據不同程度的血流感染，其體內的細菌數量會有差異，低程度的感染其血液中的細菌濃度較低而未能被提取足夠的DNA量，從而影響PCR的檢測結果顯示為假陰性。在驗證實驗方面，沈愷妮等[19]建議，根據一系列臨床及血液學指標變化以提高血培養陽性率。本研究選取了符合的血流感染樣本進行試驗，包括發熱、心率加快、呼吸急促、白細胞升高、炎癥指標上升等，以便兩種方法的比較。

EC在116份血流感染標本中有2份、KP在24份血流感染標本中有2份未能被PCR方法檢出，顯示為假陰性結果，據文獻報道，一般血流感染的成年人血液中的細菌<1～10 CFU/mL[5]，所以，筆者認為，假陰性結果與標本中細菌濃度較低有關，在采集患者標本后先進行預培養以提高細菌濃度，再進行PCR檢測有利于降低假陰性發生率。本研究結果顯示，95%以上傳統血培養方法陽性的標本與建立的多重PCR方法比較，可獲得一致的結果，對血標本先進行4 h的預培養可獲得PCR方法需要的檢測量，而延長預培養時間亦有利于提高準確率。

4 結 論

本研究研發了一種可診斷敗血癥的多重PCR方法，可同時對EC、KP、SA和MRSA 4種目標致病菌進行檢測。與傳統血培養方法比較，多重PCR方法的特異性為100%，準確率為97.9%(183/187)，而檢測所需時間，多重PCR方法為8.3 h，傳統血培養方法陽性為60 h，陰性為5 d。與傳統培養方法比較，本研究提供了一種高準確率、快速、簡單的敗血癥檢驗方法。