長沙某醫院結核分枝桿菌耐藥基因分布情況分析

潘建華，石國民，馬小華，向延根

(長沙市中心醫院檢驗科，湖南長沙 410004)

WHO 2016年結核病報告指出，我國結核病患者數量居世界第3位，是世界上30個結核病高負擔國家之一[1]。據WHO估算，中國每年新發結核病患者數量多達900 000例，每年新發耐多藥結核病患者70 000例。耐藥結核分枝桿菌(MTB)的傳播是防控結核病的主要威脅之一，治療每例耐多藥結核患者的費用是治療藥物敏感患者費用的20倍。快速檢測MTB及其耐藥性可精準治療患者，縮短病程，減輕患者痛苦，有效降低耐藥菌株的傳播。為了解本院MTB的耐藥基因ropB、KatG和inhA流行病學情況，探索適合本院快速篩選MTB耐藥菌株的方法，本研究對本院2014年7月至2017年3月基因芯片技術檢測MTB耐藥基因的數據進行了回顧性分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集本院2014年7月至2017年3月分離的MTB 1 981株。

1.2儀器與試劑 北京奧博生物生產的Extractor36核酸快速提取儀、HybSet基因微陣列芯片雜交盒、SlideWasherTM8芯片洗干儀和LuScan10K-B微陣列芯片掃描儀等；PCR擴增儀為美國ABI 7300；MTB耐藥基因檢測試劑由北京博奧生物生產。

1.3方法

1.3.1核酸提取 從Middlebrook7H9液體培養基中吸取相當于1個麥氏單位濁度的菌懸液15 μL于核酸提取管中，加入80 μL核酸提取液試劑，于Extractor36核酸快速提取儀振蕩5 min，95 ℃金屬浴5 min，5 000 r/min離心1 min，將收獲的核酸提取液放置于-20 ℃暫存。

1.3.2核酸擴增 PCR擴增試劑1、2和3平衡至室溫，瞬時離心至管底，分裝成每管18 μL，分別加入模板DNA 2 μL。擴增程序:37 ℃ 600 s;94 ℃ 600 s;94℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環；94 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，10個循環；72 ℃ 420 s；置于冰水浴中。

1.3.3芯片雜交 按9 μL雜交緩沖液加3 μL擴增產物的比例配制雜交反應物，加熱至95 ℃變性5 min，立即冰水浴5 min。產物1為產物對照，與2種微陣列均進行雜交。產物2為rpoB基因的擴增產物，與利福平微陣列相對應；產物3為katG基因及inhA基因啟動子的擴增產物，與異煙肼微陣列相對應。取13.5 μL混合液加入雜交芯片加樣孔中，置入HybSet芯片雜交盒中50 ℃雜交2 h。

1.3.4洗滌、干燥及掃描 依次以2×標準枸櫞酸水(SSC)+0.2%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.2×SSC各振蕩洗滌3 min，800 r/min離心5min，甩干后掃描、判讀結果。

1.3.5質量控制 每次擴增時均使用陽性對照和陰性對照，其中陽性對照可用于PCR 擴增和雜交過程的質控，陰性對照可用于監測環境及操作過程中的污染情況；每張芯片上均設置空白對照、陰性和陽性內對照、表面化學質控探針、雜交陽性外對照探針及野生型探針，用于監控雜交過程。

1.4統計學處理 采用SPSS18.0統計軟件對數據進行分析,計數資料以率(%)表示，采用描述性統計分析。

2 結 果

2.1一般情況 2014年7月至2017年3月共檢測MTB耐藥基因患者1 981例，其中男1 330例(67.14%)，女651例(32.86%)，除30～<40歲年齡組男女比例相當外，其余各年齡組男性均明顯多于女性。見表1。

表1 不同性別、年齡結核病患者情況比較[n(%)，n=1 981]

2.2MTB ropB耐藥基因檢出結果 1 981株MTB經基因芯片技術檢測為ropB野生型1 646株，突變型335株，突變率為16.91%(335/1 981)。共檢測耐利福平rpoB基因6個位點，突變類型13種。突變位點突變率由高至低依次為531[50.75%(170/335)]、516[21.19%(71/335)]、526[17.0%(157/335)]、511[14.33%(48/335)]、513[2.69%(9/335)]、533[2.39%(8/335)]。突變型分布見表2。

表2 335株耐利福平MTB ropB基因突變類型分布情況

2.3MTB異煙肼耐藥基因檢出結果 1 981株MTB經基因芯片技術檢測共檢測出KatG野生型1 670株，KatG突變株310株，突變率為15.65%(310/1 981)； inhA野生型1 913株，inhA突變型68株，突變率為3.43%(68/1 981)，9株為二者合并突變株。總突變率為18.6%(369/1 981)，其中KatG AGC→ACC突變型占所有耐異煙肼MTB突變總數的79.95%(295/369)。2個基因的突變型分布見表3。

表3 369株耐異煙肼MTB KatG和inhA基因突變譜及突變率

3 討 論

基因芯片技術是近年來興起的MTB耐藥基因檢測新技術，在國內多中心驗證結果顯示，該方法檢測利福平耐藥靈敏度和特異度為87.56%和97.95%，檢測異煙肼耐藥靈敏度和特異度為80.34%和95.82%[2]。基因芯片法對利福平耐藥基因的檢測與表型檢測符合率達95.0%以上[3]。

rpoB基因突變絕大部分集中在RRDR 81 bp的密碼子上[4-5]。本院531位點突變率最高，占50.75%，與青島地區52.6%[6]接近,低于深圳的76.3%[7]；ropB基因突變率為16.91%(335/1 981)，略高于作者2016年進行的耐藥表型的研究數據(13.57%)[8]，低于貴州的20.16%[9]。

異煙肼耐藥相關突變發生率具有較大的地區差異性。本研究結果顯示，異煙肼耐藥基因KatG突變率為15.65%，inhA突變率為3.43%，二者合計異煙肼耐藥基因突變率為18.6%，略高于作者2016年進行的耐藥表型的研究數據(14.18%)[8]，與貴州類似[10]。KatG AGC→ACC突變率為79.95%，inhA突變率為18.7%。與青島[6]一致，接近深圳地區的84.6%[11]，高于福州的70.7%[12]、浙江的69.3%[13]和武漢的60.9%[14]。

耐藥表型與基因型之間不一致的原因可能有：(1)芯片沒有覆蓋所有的突變位點或突變基因型；(2)芯片檢測到的突變型可能是未引起耐藥的同義或錯義突變；(3)傳統藥敏試驗檢測以臨界水平判斷耐藥，而基因芯片法能檢測到比傳統藥敏試驗臨界水平更低的低度耐藥突變菌株。這些因素均可能對最終結果產生影響。

4 結 論

ropB基因531、516、526和511位點突變和KatG G→C突變是導致長沙市中心醫院MTB利福平和異煙肼耐藥的主要因素，基因芯片技術可作為本院MTB耐藥基因的快速篩選方法。