Klotho蛋白早期診斷嚴重創傷導致AKI的價值

楊銀忠，程文霞，陳敏敏，趙 鵑

(四川省人民醫院東院檢驗科，四川成都 610101)

近年來，隨著我國城市建設及社會的飛速發展，車禍傷、高墜傷、打擊傷等創傷已嚴重威脅人類的生命安全，急性腎損傷(AKI)是嚴重創傷后臨床常見的并發癥。據統計，嚴重創傷后AKI發生率為30%～50%,且發病率呈逐年上升趨勢，病死率可高達29%～90%[1-2]。傳統的實驗室檢測腎損傷的指標主要有血肌酐(Scr)和尿量等，以估測腎損傷程度，但這些指標異常時患者腎實質有可能已發生不可逆轉損傷。目前，早期診斷AKI尚不理想，因此，尋找快速、便捷、靈敏度和特異度高的生物學標志物對預測及早期診斷意義重大。Klotho 蛋白是體內Klotho基因編碼的一種單向跨膜蛋白，主要在腎小管上皮細胞中表達。有研究表明，在早期腎損傷時Klotho等基因表達改變，Klotho蛋白在血漿中水平較高，但在正常細胞及腎損傷修復后水平均較低，是反映AKI的一種理想標志物[3-4]。本研究通過觀察嚴重創傷后AKI患者血清Klotho蛋白水平的動態變化，旨在探討該血清標志物早期診斷AKI的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年3-12月該院重癥監護室收治的嚴重創傷后1周內發生AKI患者43例作為AKI 組，其中男23例，女20例；平均(38.22±8.91)歲。車禍傷25例，高墜傷7例，擠壓傷5例，刀刺傷3例，其他傷3例。排除既往有慢性腎臟病史、正在服用免疫類或糖皮質激素類藥物和存在惡性腫瘤等基礎疾病患者。選擇年齡、性別、病因及手術方式與AKI組相匹配的40例創傷非AKI (NAKI)患者作為NAKI組，其中男21例，女19例；平均(38.23±8.01)歲。再隨機選擇健康對照組40例，其中男20例，女20例；平均(37.7±7.43)歲。各組研究對象性別、年齡比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。所有診斷為AKI的病例均符合2005年急性腎損傷網絡(AKIN)和2002急性透析質量倡議(ADQI)推薦的診斷標準：48 h內腎功能突然下降，血肌酐(Scr)絕對值增加≥26.4 μmol/L或達到基線值的1.5倍或尿量<0.5 mL/(kg·h)且持續超過6 h。本研究經醫院倫理委員會批準，符合醫學倫理要求。

1.2樣本收集和指標測定

1.2.1樣本收集 收集患者術前(入院15 min內),術后2、4、6 h的血液樣本各4 mL，4 000 r/min離心1 min取上清液進行檢測。

1.2.2Klotho蛋白檢測 采用美國Cusabio公司生產的酶聯免疫吸附測定試劑進行檢測，嚴格按試劑盒說明書制定的操作規程進行操作，其實驗原理為用純化的抗體包被微孔制成固相載體，往包被抗Klotho蛋白抗體的微孔中依次加入標本和標準品、生物素化的抗Klotho蛋白抗體、HRP標記的親和素等，經徹底洗滌后底物四甲基聯苯胺(TMB)顯色，顏色深淺與樣本中Klotho蛋白量呈正相關，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，計算樣本濃度。

1.2.3Scr檢測 采用九強公司生產的肌氨酸氧化酶法試劑盒，采用美國Beckman-Coulter 5800全自動生化儀進行檢測，嚴格按實驗室操作規程進行操作。

2 結 果

2.1各組研究對象Klotho蛋白水平比較 AKI組患者術前(入院15 min內)，術后2、4、6 h Klotho蛋白水平與NAKI組與健康對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；AKI患者術前(入院15 min內)Klotho蛋白水平升高，術后2、4、6 h逐漸下降。見表1。AKI組患者各時間點Scr水平比較及與NAKI組和健康對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組研究對象Klotho蛋白水平比較

注：-表示無數據

表2 AKI與和對照組Scr的檢查水平及比較

注：-表示無數據

2.2Klotho蛋白的診斷效能 Klotho蛋白在術前(入院15 min內)，術后2、4、6 h的受試者工作特征曲線(ROC)曲線下面積(AUC)分別為0.955、1.000、1.000、1.000，Klotho蛋白在術前(入院15 min內)，2、4、6 h的臨床診斷臨界點分別為0.122、0.165、0.144、0.101 ng/mL。見圖1、表3。

圖1 ROC曲線圖

時間AUCSDP95%CI術前(入院15 min內)0.9550.0320.0000.892～1.000術后2 h1.0000.0000.0001.000～1.000術后4 h1.0000.0000.0001.000～1.000術后6 h1.0000.0000.0001.000～1.000

3 討 論

Klotho蛋白最初是在1997年由韓國科學家Kuroo在抗衰老研究中被發現的，其是體內Klotho基因編碼的一種單向跨膜蛋白，主要表達在腎小管上皮細胞中，可在血液及尿液中檢查到。近年來，HU等[5]研究表明，在AKI大鼠和小鼠中隨腎功能損傷的進展，腎臟、血液和尿液中Klotho蛋白水平均顯著減低，當腎功能恢復后體液和組織中Klotho蛋白水平又可恢復到正常水平。在研究AKI患者的尿液時也發現，Klotho蛋白水平顯著減低，提示AKI是一種Klotho蛋白缺失的急性、暫時性病理狀態[6]。同時，有研究表明，Klotho蛋白缺陷可加重缺血再灌注導致的組織損傷，而Klotho蛋白的過表達可緩解損傷，進一步證明Klotho蛋白表達變化在臟器缺血再灌注損傷的病理生理過程中具有重要作用，其有可能作為診斷AKI的一個新的標志物。目前，嚴重創傷后AKI相關Klotho蛋白指標的動態變化尚未見文獻報道。

當患者發生嚴重創傷后腎臟是最易受累的器官之一，在創傷失血、臟器受損和休克等多種因素作用下，機體處于應激狀態，直接導致腎臟血流量灌注不足或缺血，從而引起腎組織損傷，導致AKI的發生。有研究表明，創傷后發生AKI的原因與炎癥介質過度活化和表達密切相關，在受損早期腎臟會及時自我維護及修復，包括早期阻止炎癥細胞活化及炎癥介質的釋放等[7]。

目前，有研究表明，Klotho蛋白具有調節細胞表面多種糖蛋白的激素樣因子功能，如上調熱休克蛋白70表達等，提高抗凋亡蛋白穩定性和間接抑制氧化應激，通過抑制細胞內相關傳導信號，上調抗氧化酶類的表達，在阻止早期炎癥細胞活化和炎癥介質釋放方面具有一定作用[5-6]。因此，當機體發生嚴重創傷導致AKI后腎組織細胞凋亡導致Klotho蛋白表達下調，Klotho蛋白則作為一種激素樣因子發揮抗凋亡、抗炎、抗氧化等作用，從而導致血液濃度發生相應改變。本研究通過比較AKI組、NAKI組和健康對照組研究對象血清Klotho蛋白發現，AKI組患者Klotho蛋白水平術前(入院15 min內)，術后2、4、6 h均明顯高于NAKI組和健康對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，但各組研究對象Scr水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，表明AKI患者術前(入院15 min內)及術后6 h內Klotho蛋白水平變化比Scr更早，對AKI的早期診斷價值明顯優于Scr，與相關動物實驗研究結果基本吻合[4-6]。

本研究在不同時間點AKI組患者Klotho蛋白檢測結果比較發現，患者Klotho蛋白水平術前(入院15 min內)已升高，術后2、4、6 h逐漸下降，而術后6 h內Scr水平無多大變化，表明Klotho蛋白是預測嚴重創傷導致腎損傷早期診斷的良好指標，其次Klotho蛋白也可能與腎臟的修復具有一定關系[4]。但本研究與大鼠等動物實驗研究結果具有一定差別[5-6]，大鼠實驗組在創傷2 h后再逐漸降低，而本研究是AKI患者入院后就檢測到升高再逐漸降低，可能是本研究所選擇的AKI患者均為嚴重創傷患者和入院時間等因素有關。

目前，國內研究[4-8]和國外研究[9]探討了在心臟術后引起急性缺血再灌注導致AKI時Klotho蛋白的變化，但尚未查閱到其他原因導致AKI時Klotho蛋白變化的文獻。通過本研究和在心臟術后導致AKI的文獻比較后發現，Klotho蛋白均有可能作為AKI標志物的價值，但本研究Klotho蛋白變化的時間比其他文獻報道更早，可能與本研究AKI組患者創傷均較嚴重和就診時間等有關。考慮到本研究僅為小樣本單中心研究，故未來尚需多中心和多樣本進行前瞻性研究，并評估其診斷價值。

4 結 論

AKI患者Klotho蛋白水平術前(入院15 min內)已升高，術后2、4、6 h逐漸下降，而術后6 h內Scr水平無多大變化，表明Klotho蛋白是預測嚴重創傷導致腎損傷早期診斷的良好指標。檢查Klotho蛋白有助于早期診斷嚴重創傷導致AKI，可作為早期診斷的標志物。