3種肌酐測定方法的分析性能評價

王美珠，康 偉，黃勤烽，陳 敏

(福州總醫院檢驗科/全軍檢驗醫學研究所，福建福州 350025)

肌酐是肌酸代謝終產物,人體每天的肌酐生成量相當恒定，血中肌酐水平取決于腎小球濾過功能，測定肌酐水平可作為腎小球濾過率受損的指標[1]。目前，實驗室檢測肌酐常用的方法主要有苦味酸法和肌氨酸氧化酶法(簡稱氧化酶法)[2-3]，近年來，出現的另一種酶學檢測方法即亞胺水解酶法(簡稱紫外酶法)，逐漸為臨床使用[4]。為比較其性能特點，本研究對上述3種肌酐檢測方法的精密度、線性范圍、可報告范圍、方法學比對、藥物干擾及開瓶穩定性等分析性能指標進行了評價，現報道如下。

1 資料與方法

1.1標本來源 收集無溶血、黃疸和脂血的本院收治的患者及健康體檢者的新鮮臨床標本。

1.2儀器與試劑 氧化酶法和苦味酸法采用羅氏cobas 8000 c702全自動生化分析儀及其配套試劑(批號：620823、617455)和校準品(批號：10759350)。紫外酶法采用羅氏cobas 8000 c702+朗道肌酐紫外酶法檢測試劑(批號：311656)+朗道肌酐校準品(批號：1512CR)；質控品采用朗道CONTORL2(批號：821UN)和CONTORL3(批號：647UE)。干擾藥物：羥苯磺酸鈣膠囊采用寧夏康亞藥來有限公司制劑(規格：每粒0.25 g)；酚磺乙胺注射液采用山東方明藥業集團股份有限公司制劑(規格：每支0.5 g/2 mL)。

1.3方法 為確保試驗數據可靠，以下試驗均在室內質控在控的情況下進行。

1.3.1精密度試驗

1.3.1.1批內精密度 依照美國臨床和實驗室標準化協會(CLIS)EP5-A2文件要求，選擇接近醫學決定水平標本2份，在2 h內，各進行20次重復測定，計算其均值、標準差(SD)及變異系數(CV%)。要求所有檢測數據中超出2SD的數據不超過2個。批內精密度<1/4允許總誤差(TEa)為合格。

1.3.1.2批間精密度 取朗道質控品CONTORL2、CONTORL3的2個水平，按每天4批、每批2個水平、每批間隔2 h的檢測頻率，連續檢測5 d，計算其均值、SD及CV%。批間精密度<1/3 TEa為合格。

1.3.2線性范圍試驗 依照CLIS EP6-A文件要求，取2個接近廠家聲明線性范圍上限(H)、下限(L)的混合血清，按1 L、0.9 L+0.1 H、0.8 L+0.2 H、0.7 L+0.3 H、0.6 L+0.4 H、0.5 L+0.5 H、0.4 L+0.6 H、0.3 L+0.7 H、0.2 L+0.8 H、0.1 L+0.9 H、1 H的比例配制成11個系列濃度標本，重復測定3次，在短時間內測定完成。以預期值為X，實測值為Y，以線性回歸分析獲得回歸方程后計算驗證線性范圍。

1.3.3可報告范圍驗證 取一份濃度落在線性范圍內的高濃度患者標本，用廠家推薦的稀釋液(生理鹽水)進行5、10、20、50、100倍稀釋，每個濃度重復測定3次，以樣品原倍結果為預期值，稀釋后測定的結果為檢測值，計算各稀釋倍數的回收率，應為90%～110%。

1.3.4方法學比對 依照CLIS EP9-A2文件，每天收集8份標本，隨機編號，按順序和反序測定2次，共測定5 d。所有標本均在2 h內測定完成。統計數據，剔除離群值。

1.3.5藥物干擾試驗 依照CLIS EP7-A2 文件，通過配對差異干擾實驗和劑量效應實驗，分析藥物：羥苯磺酸鈣(商品名：昊暢)和酚磺乙胺(商品名：止血敏)對3種肌酐檢測方法的干擾。

1.3.5.1配對差異干擾實驗 按說明書描述，口服羥苯磺酸鈣膠囊500 mg，4 h達血藥濃度峰值，峰質量濃度為14.5 μg/mL，故本研究選取0.0、14.5 μg/mL分別為羥苯磺酸鈣的最低和最高測試質量濃度，貯存液質量濃度為290 μg/mL。根據說明書描述，酚磺乙胺治療的血藥濃度為0.5～1.5 g/d，入血后l h達血藥濃度高峰，4～6 h完全排泄，故本研究中選取0.0、0.3 g/L分別為酚磺乙胺的最低和最高測試質量濃度，貯存液質量濃度為6 g/L。取3.8 mL配制的高肌酐值的混合血清加入藥物貯存液0.2 mL作為試驗組,3.8 mL髙肌酐值血清加入0.2 mL去離子水作為對照組。分析羥苯磺酸鈣、酚磺乙胺對3種肌酐測定方法的干擾度。根據分析物的生理變異確定肌酐的TEa為6.9%[5],建立具有臨床意義差別的可接受標準的最大允許干擾值(dmax)。根據CLIS EP7-A2文件提供的dmax/s計算試驗重復次數為3次。根據CLIS EP7-A2文件，95%CI的下限超過最大允許誤差[5]即認為有干擾。

1.3.5.2劑量效應試驗 依照CLIS EP7-A2文件，制備一系列不同濃度的干擾測試樣本，以高濃度測試標本和低濃度對照標本按一定比例混合，制備方法見表1。

表1 劑量效應試驗標本配制

1.3.6試劑穩定性驗證 3種試劑定標后放置于羅氏cobas 8000 c702全自動生化分析儀試劑倉，分別于第1、2、3、4、5、6、7天測定朗道CONTORL2和CONTORL3，記錄統計檢測結果。

1.4統計學處理 采用EXCEL2007軟件對數據進行分析。

2 結 果

2.1精密度 參照國家衛生行業標準《臨床生物化學常規項目分析質量指標》(WS/T403-2012)的要求，肌酐分析允許TEa為±12%，以CV批內%<3%(<1/4TEa),CV批間%<4%(<1/3TEa)為標準，3種檢測方法均符合要求，結果見表2。

表2 批內、批間精密度測定結果(%)

2.2線性范圍評估 3種肌酐測定方法線性范圍評估結果見表3。

表3 3種肌酐測定方法線性范圍評估結果

2.3可報告范圍 高濃度樣本經5、10、20、50倍稀釋后回收率為90%～110%。3種肌酐測定方法可報告范圍評估結果見表4。

表4 3種肌酐測定方法可報告范圍評估結果

2.4不同方法學比對 紫外酶法與氧化酶法回歸方程為Y=0.948X+10.35(R2=0.999 2)。見圖1；紫外酶法與苦味酸法回歸方程為Y=0.966X+4.683(R2=0.999 6)。見圖2。

2.5藥物干擾

2.5.1配對差異干擾實驗 羥苯磺酸鈣、酚磺乙胺對氧化酶法測定肌酐有負干擾，對其他2種方法無干擾，見表5、6。

圖1 紫外酶法與氧化酶法相關性分析

圖2 紫外酶法與苦味酸法相關性分析

檢測方法對照組實驗組95%CI最大允許誤差結果判斷紫外酶法436431-28～1830無干擾氧化酶法420328-104～-8029負干擾苦味酸法412409-17～1128無干擾

表6 酚磺乙胺配對差異試驗結果

2.5.2劑量效應試驗 羥苯磺酸鈣、酚磺乙胺均對氧化酶法檢測肌酐存在干擾。干擾效應=試驗組均值-對照組均值，結果見表7。羥苯磺酸、酚磺乙胺均對氧化酶法產生負干擾，其干擾效應與不同藥物濃度的最佳擬合曲線方程見圖3、4。羥苯磺酸鈣對氧化酶法檢測肌酐的干擾效應為線性回歸方程，產生干擾的最小有效質量濃度為5.23 μg/mL。而酚磺乙胺對氧化酶法檢測肌酐的干擾效應為非線性回歸方程，產生干擾的最小有效質量濃度為0.016 g/L。

表7 劑量效應試驗

圖3 羥苯磺酸鈣干擾試驗的線性效應圖

圖4 酚磺乙胺干擾試驗的非線性效應圖

2.6試劑穩定性試驗 隨著開瓶時間的增加，苦味酸法檢測結果呈明顯持續下降，室內質控在開瓶第3天即提示失控，第7天的檢測結果與第1天比較，CONTORL2下降了42.5%,CONTORL3下降了34.4%，必須通過每天定標方可穩定結果；而2種酶法則表現穩定，第7天的結果與第1天無明顯變化，見圖5。

圖5 試劑穩定性試驗

3 討 論

隨著生化檢驗自動化的普及和質量控制措施的完善，生化檢驗結果的重復性和準確性已顯著提高。但對有多種檢測方法的項目如肌酐，市場供應的商品試劑品種多樣，加上檢測系統、測定方法及抗干擾能力的不同，使不同方法檢測結果之間依然存在明顯差異[6]。因此，實驗室應該對所用方法進行系統評價，以明確其性能特點及檢測局限性。

精密度既是臨床檢驗的方法評價，也是儀器性能評價的重要指標之一[7]。3種肌酐檢測方法的精密度均符合廠家申明要求，同時，也滿足WS/T403-2012的要求。定量檢測項目在分析測量范圍內儀器最終輸出的信號和分析物濃度呈線性是儀器性能的重要指標，也是保證檢驗結果準確性的理論依據。對檢測項目進行線性評價有助于發現方法學原理、儀器、校準品、試劑、操作程序、質控計劃等很多方面的誤差來源[8]。本研究結果顯示，3種肌酐檢測方法均線性良好，3種方法可報告范圍評估完全可滿足臨床檢測需要。方法學比對實驗是實現患者標本檢測結果可比性與準確度溯源的重要途徑，本研究結果顯示，對無干擾物存在的正常標本，3種肌酐檢測方法學之間具有良好的相關性。

干擾物是臨床實驗室檢測誤差的一個很重要的來源[9]，其中患者治療期間的物質介入是重要因素，臨床試驗分析前藥物的影響因素時有發現[10]。本研究結果顯示，羥苯磺酸鈣在最小質量濃度為5.23 μg/mL、酚磺乙胺在最小質量濃度為0.016 g/L時即對氧化酶法產生負干擾，而對苦味酸法和紫外酶法無影響。3種藥物對氧化酶法檢測肌酐的干擾與其還原性有關[11-13]。據文獻報道，膽紅素對苦味酸法檢測肌酐具有顯著影響，存在明顯干擾[14-16]；維生素C對氧化酶法和苦味酸法均有不同程度干擾[17-18]，而膽紅素、乳糜、抗壞血酸、溶血及常用藥物均不干擾紫外酶法[19-20]。本研究試劑穩定性試驗結果顯示，苦味酸試劑的在機穩定性較差，在控時間僅為2 d，明顯少于說明書聲明的7 d，而其他2種方法在機穩定性均較好。

4 結 論

綜合分析3種方法的精密度、線性范圍、可報告范圍、抗干擾能力及試劑穩定性，氧化酶法及苦味酸法具有明顯的缺點。而紫外酶法的性能符合臨床測定的需求，又具有較好的抗干擾能力，在3種肌酐測定方法中為最可靠的方法，應作為實驗室的首選方法。