液相芯片系統(tǒng)在檢測抗核抗體譜中的應用

張 程，吳姍姍，呂 丹

(遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科,遼寧沈陽 110032)

抗核抗體是以真核細胞核內的DNA、RNA、蛋白或這些物質的分子復合物產生的自身抗體。按其核內各個分子的性能不同可將各抗核抗體區(qū)分開來，如抗雙鏈DNA抗體(dsDNA)、抗組蛋白抗體、抗核仁抗體等。目前，抗核抗體靶抗原的分布已由傳統(tǒng)的細胞核成分擴散至整個細胞，細胞質、細胞膜等結構均可成為自身免疫系統(tǒng)的目標抗原，無器官特異度和種屬特異度[1]。抗核抗體可特征性地出現(xiàn)在自身免疫性疾病中，對疾病的活動性及預后、治療反應均具有一定的臨床意義[2]。現(xiàn)有的檢測自身免疫性疾病的方法主要有間接免疫熒光法(IFA)、線性免疫印跡法(LIA)等[3]，而這些方法存在需要血清量大、費時費力等缺點[4]。近年來，液相芯片技術已得到廣泛應用，包括對可提取核抗體的檢測均得到了認可[5]。該法提供了一種快速而靈敏的技術手段，通過對單一微球表面進行多種抗原的包被而實現(xiàn)相應抗體的同時檢測，達到快速、靈敏的目的[2]。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院收治的已確診為自身免疫性疾病患者120例，其中男45例，女75例。選擇健康對照組血清90例。研究對象均已簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 AtheNA Multi-Lyte自身抗體檢測試劑盒由美國宙斯公司提供。

1.3檢測方法 液相芯片(AtheNA法)可半定量檢測的抗體包括Ro52、SSA、SSB等15種。比對方法包括IFA法和LIA法。3種檢測方法均嚴格按試劑盒說明書要求進行操作。IFA法以任一核型滴度>1∶100為陽性標準，LIA法和AtheNA法以檢測抗核抗體譜中任一種抗體陽性為陽性標準。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行學分析，計數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗；采用kappa一致性檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.13種檢測方法陽性率比較 病例組AtheNA法、IFA法和LIA法檢測陽性率分別為61.7%、71.7%和50.8%;健康對照組分別為6.7%、5.6%和5.6%，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2AtheNA法與LIA法檢測15種抗體結果比較 除抗dsDNA抗體外，AtheNA法總符合率超過85.0%。2種檢測方法檢測抗dsDNA抗體具有高度一致性，其他14種抗體檢測結果一致性極佳。表明AtheNA法具有較高的靈敏度。見表2。

表1 3種檢測方法陽性率比較[n(%)]

2.3交叉反應驗證及標準曲線 1種微球僅針對其待測抗原發(fā)出高強度熒光，導致該種抗原只與其對應的抗體結合而并不與其他蛋白標志物結合，因此，抗體之間無交叉反應存在。由于目前缺乏抗核抗體譜抗體的國際校準品，所以無法通過聯(lián)合檢測的標準曲線去溯源，但AtheNA法可通過攜帶抗體的微球數(shù)來半定量反應抗體水平，而LIA法無法實現(xiàn)，所以，與LIA法比較，AtheNA法能實現(xiàn)半定量檢測，提高靈敏度，滿足臨床檢測需求。

表2 AtheNA法與LIA法檢測15種抗體結果比較

3 討 論

抗核抗體檢測對自身免疫性疾病的診斷已有50多年的歷史，尤其診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡的靈敏度幾乎達100%，抗核抗體陽性對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的預測也具有較為重要的作用[6-8]。目前，常用的有免疫擴散法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫印跡法、液相芯片法和LIA法。隨著抗原提純技術的提高，LIA法、免疫印跡法和液相芯片法被越來越多的實驗室所采用。

液相芯片是新一代高通量生物芯片技術，因其具有高精準、特異性強等優(yōu)勢可同時綜合分析多種標志物，在自身免疫、腫瘤篩查等方面體現(xiàn)出較高的診斷價值。傳統(tǒng)的“金標準”酶聯(lián)免疫吸附試驗雖然靈敏度較高，但每一反應孔只能檢測一種抗體，當多種抗體同時檢測就變得繁瑣、費時，AtheNA法的優(yōu)點：(1)高通量。液相芯片可同時檢測100種生物標志物，可通過重組蛋白不斷更新自身抗體譜來建立診斷體系。(2)用血量少。(3)操作簡便。液相芯片采用熒光分析方法，活性范圍大大增強，節(jié)省了洗滌和稀釋的時間，使實驗時間大大縮短。

有研究結果表明，由于IFA法的基質為HEP-2/猴肝細胞，細胞結構較為完整，可幾乎完全捕獲待測血清中的抗核抗體，使其檢測抗核抗體陽性率較高[9]，但其僅為定性實驗，對臨床“灰區(qū)”患者不能確切說明問題。液相芯片技術是一種以經過特殊編碼、可識別的微球作為生物分子(抗原、抗體、蛋白質、核酸等)反應及信號檢測載體的陣列分析技術。微球逐一通過檢測通道時受到雙色激光的照射，既可識別微球表面包被的分子種類；又可確定目標分子數(shù)量，所以，可半定量確定抗體的水平，達到實現(xiàn)高精準的目的[10-12]。

本研究以LIA法作為參照，采用AtheNA法對15種抗核抗體進行了檢測，結果顯示，2種方法具有較高的一致性。LIA法因其各模塊上抗原濃度不詳，不可根據(jù)顯色條帶的深淺度來判斷待測抗體的水平[13-15]。而液相芯片通過每個微孔板中的大量微球，再配合不同激光的發(fā)射，可較精確地區(qū)別抗體，并實現(xiàn)待測抗體的半定量檢測[16-18]。

4 結 論

液相芯片系統(tǒng)對抗核抗體的聯(lián)合檢測具有良好的性能，其對抗核抗體譜的檢測具有較好的靈敏度和特異度。