Y-l’蘋果矮化砧木初代培養(yǎng)

王國平 劉偉 史華平 樊新萍

摘要：為建立蘋果矮化砧木‘Y-1'初代培養(yǎng)體系，以大田'Y-1'當(dāng)年生幼嫩枝條莖段為外植體，對消毒劑的選擇、外植體采集時(shí)間和初代培養(yǎng)中植物生長調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：先用75%酒精處理30s，再用0.1% HgCIz處理5 min是蘋果矮化砧木‘Y-1莖段滅菌的最佳方法，其外植體成活率高達(dá)66. 46%;外植體最佳取材時(shí)間是5月初，接種后外植體的污染率明顯低于它取材時(shí)間，而芽的成活率、萌發(fā)率則顯著提高。MS+1.O mg/L 6 - BA+O.5 mg/L IBA是蘋果矮化砧木‘Y-I莖段腋芽萌發(fā)的最適宜培養(yǎng)基，萌發(fā)率高達(dá)79. 15%;

關(guān)鍵詞：‘Y-1蘋果矮化砧木;初代培養(yǎng);污染率;萌發(fā)率

中圖分類號：S661.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1674-9944（ 2019） 24-0053-04

l 引言

‘Y-I蘋果矮化砧木（原代碼Y- B030），是山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所蘋果砧木課題組從2001年開始，以蘋果屬野生砧木資源晉西北山定子（Malus bacca-ta）為材料，采用大群體實(shí)生選育技術(shù)，經(jīng)過十年的區(qū)域試驗(yàn)和生產(chǎn)實(shí)踐，選育出的抗逆性強(qiáng)、矮化效果明顯、綜合經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良的蘋果矮化砧木新品種，于2013年3月通過了山西省農(nóng)作物品種審定委員會審定[1]。該砧木嫁接品種樹體矮化、抗寒、抗旱、早花早果、親和性好等特性極為突出，可在我國華北、西北、東北及類似晉西北自然條件寒冷、干旱、貧瘠的蘋果產(chǎn)區(qū)栽培[2]。

多年來，‘Y-I蘋果矮化砧木的推廣主要通過中間砧形式[1]，利用這種嫁接方法，矮化砧木的特性不能充分體現(xiàn)，尤其在樹體矮化、果實(shí)品質(zhì)和樹體適應(yīng)性方面表現(xiàn)明顯[3]。而且，育苗步驟要比常規(guī)育苗多嫁接一次，使得嫁接、田間苗木管理程序繁瑣，延長了苗木出圃周期，費(fèi)時(shí)費(fèi)工，成本高。而自根砧育苗具有結(jié)果早、產(chǎn)量高、品質(zhì)好、育苗方式簡單、長勢一致、繁育所需年限較短等優(yōu)點(diǎn)，它對蘋果樹的生長、開花、結(jié)果、抗逆能力等產(chǎn)生直接影響，是目前高標(biāo)準(zhǔn)建園的最佳選擇[4]。隨著近年來蘋果栽培產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，自根砧在生產(chǎn)實(shí)際中的重要作用尤為突出。我國蘋果自根砧繁育技術(shù)相對薄弱，已成為制約我國蘋果苗木良種良砧快速發(fā)展的一個(gè)瓶頸[5]。因此，進(jìn)行‘Y-I蘋果矮化砧木的無性繁殖研究，實(shí)現(xiàn)其自根苗的生產(chǎn)，使得砧木自身優(yōu)勢能夠充分發(fā)揮，顯得尤為重要。矮化自根砧苗的獲得必須利用無性繁殖技術(shù)，而組織培養(yǎng)技術(shù)作為無性繁殖技術(shù)中的關(guān)鍵技術(shù)，以繁殖速度快、繁殖系數(shù)大，繁殖后代整齊一致，能夠保持原有品種的優(yōu)良性狀，可以周年生產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)被優(yōu)先應(yīng)用[6，7]。尤其是針對通過扦插、壓條等無性繁殖技術(shù)方法難以獲得‘Y-1蘋果矮化砧自根苗，組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用就成為唯一選擇。目前，‘Y-I'蘋果矮化砧木組培方面的研究還未見報(bào)道。

在植物組織培養(yǎng)繁育中，初代培養(yǎng)是組織培養(yǎng)技術(shù)中的首要環(huán)節(jié)。本試驗(yàn)嘗試通過以帶腋芽的幼嫩莖段作為外植體，通過研究探索‘Y-1'蘋果矮化砧木在組織培養(yǎng)中的外植體最佳消毒劑的選擇、最佳外植體采集時(shí)間的確定和在不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合的培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)效果對比，對‘Y-1蘋果矮化砧木初代培養(yǎng)階段技術(shù)進(jìn)行研究。旨在為‘Y-1'蘋果矮化砧木的快速繁殖和大力推廣及工廠化生產(chǎn)提供理論及操作技術(shù)依據(jù)，以滿足市場對‘Y-1蘋果矮化砧木的迫切需求。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

2.1.1 試驗(yàn)材料來源

供試材料采自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所蘋果砧木課題組。在生長季節(jié)，選取生長健壯、潔凈且無病蟲害植株的新生幼嫩枝條，剪取30～40 cm的枝條，去掉葉片，葉柄留2～3 mm，裝入保鮮袋中，用冰袋和干凈的濕毛巾低溫保存，立即帶回組培室進(jìn)行無菌化處理。

2.1.2 試驗(yàn)材料預(yù)處理

首先用小刷子蘸取肥皂液將附于枝條上的塵土和其他粘著物刷洗干凈，隨后用自來水沖洗0.5 h。將枝條截成單芽莖段，放入盛有無菌水的瓶中，帶至無菌超凈工作臺上。在無菌超凈工作臺上，將放有單芽莖段瓶中的無菌水倒掉，用裝有70%醫(yī)用酒精的小噴壺將單芽莖段噴濕，約30 s后，將多余酒精倒掉，用不同消毒劑進(jìn)行處理。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 不同消毒試劑及其不同濃度試驗(yàn)

在植物初培過程中，消毒劑主要有HgC12，過氧化氫、NaCIO等[8]。不同試驗(yàn)材料，對滅菌劑的種類和濃度要求各不同。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)主要用HgCI2和的NaCIO。HgCl2分3個(gè)濃度處理，分別為0. 05%，0.1%，0.15%;NaCIO分3個(gè)濃度處理，分別為10%，15%，20%。消毒劑浸泡時(shí)間為5 min。每個(gè)處理時(shí)間達(dá)到后，將浸泡好的單芽莖段用無菌水沖洗3次。將單個(gè)單芽莖段取出，在無菌接種盤上用無菌濾紙吸干材料表面水分，將莖段兩則各剪去0. 3～0.5 cm，接種于MS培養(yǎng)基上（pH值為5.8），每瓶接種1個(gè)莖段，每個(gè)處理接種單芽莖段30個(gè)。7d后開始觀察外植體污染及腋芽萌發(fā)情況，連續(xù)定期觀察‘Y-I蘋果矮化砧木莖段污染和生長情況20 d后，統(tǒng)計(jì)污染、成活和萌芽情況[9]，（以下做法類同）。其計(jì)算公式如下：

污染率=（污染數(shù)/接種數(shù)）×100%;

成活率=（成活數(shù)/接種數(shù)）×100%;

萌發(fā)率=（萌芽數(shù)/接種數(shù)）×100%。

2.2.2 不同取材時(shí)間試驗(yàn)

在初培試驗(yàn)中，由于試驗(yàn)材料均取于大田，不同時(shí)間段，其木質(zhì)化程度和菌落均不同，消毒結(jié)果也截然不同[10]。為了確定外植體適宜的采集時(shí)間，從5月到8月，在不同時(shí)間進(jìn)行了7次初培試驗(yàn)，具體時(shí)間分別為：5月5日、5月12日、5月27日、6月3日、6月20日、7月23日、8月24日。

2.2.3 初代培養(yǎng)植物生長調(diào)節(jié)劑配方篩選試驗(yàn)

初培獲得無菌嫩枝，不僅取決于植物生長調(diào)節(jié)劑濃度，生長調(diào)節(jié)劑之間比例也是關(guān)鍵，該試驗(yàn)以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以生長素IBA和細(xì)胞分裂素BA作為試驗(yàn)因子，研究二者配合使用的效果。在預(yù)備試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，IBA濃度分別為：0.3 mg/L、0.5 mg/L、1.O mg/L; BA濃度分別為：1.O mg/L、1.5 mg/L、2.O mg/L。二者不同濃度進(jìn)行完全組合試驗(yàn)。

2.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

所用培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，每升添加瓊脂6 9，蔗糖30g，121℃滅菌20 min。外植體莖段接種后于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)室中溫度為（25±1）℃，光照強(qiáng)度為3000～4000 lx，光照周期為光/暗=16 h/8 h。

3 結(jié)果與分析

3.1 消毒劑種類及其不同濃度對‘Y-I外植體滅菌效果的影響

各滅菌處理的污染最初出現(xiàn)在接種后5d，隨后增加。接種后5d時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基表面變得粗糙、不光滑，有細(xì)菌污染的跡象，7d時(shí)部分試管瓶培養(yǎng)基中出現(xiàn)真菌菌落。首先在外植體的葉腋處出現(xiàn)少量白色的菌絲，隨后逐步增多、擴(kuò)大。到20 d時(shí)，真菌可以布滿整個(gè)外植體，并以外植體接觸培養(yǎng)基處為圓心，形成不同直徑的菌層覆在培養(yǎng)基表面;細(xì)菌污染的主要表現(xiàn)在外植體與培養(yǎng)基接觸處，形成不同大小的菌斑，顏色各異。

不同滅菌劑種類及其不同濃度處理對‘Y-1蘋果矮化砧木外植體的污染率、成活率和萌發(fā)率影響十分明顯。從表1可以看出，HgCI2和的NaClO處理外植體后，污染率隨著二者濃度的增高而下降，但同時(shí)萌發(fā)率也隨之下降。對比不同濃度HgCI。和NaCIO的處理，發(fā)現(xiàn)HgCl2的滅菌效果要好于NaCIO。其中，從污染率、成活率和萌發(fā)率綜合考慮，以0. 1% HgC12濃度處理效果最好，成活率最高為66. 46%，同時(shí)污染率也不太高，為26. 73%，萌發(fā)率為74. 36%。

3.2不同取材時(shí)間對‘Y-I外植體滅菌效果的影響

由表2可知，取材時(shí)間對外植體‘Y-I，的污染率、成活率及萌芽率都有重要影響。其中，6、7、8月份的污染率顯著高于5月份的，當(dāng)5月份第一次取材時(shí)，其污染率僅為5. 71%，顯著低于其它取材時(shí)間;就存活率而言，5月的成活率也顯著高于6、7、8月份，其中5月5日取材的外植體存活率能達(dá)到65. 45%;不同取材時(shí)間的外植體在滅菌接種后的萌發(fā)率也是5月份最高。因此，5月初是‘Y-1'蘋果矮化砧木外植體最佳取材時(shí)間。

3.3 ‘ Y-I初代培養(yǎng)植物生長調(diào)節(jié)劑配方篩選試驗(yàn)

試管苗的形成不僅取決于生長調(diào)節(jié)劑的濃度，還取決于生長調(diào)節(jié)劑之間的比例，該試驗(yàn)以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以生長素IBA和細(xì)胞分裂素BA作為供試因子，研究二者配合使用的效應(yīng)，結(jié)果見表3。接種后1周左右，芽開始萌動;繼續(xù)生長1周后，葉片逐漸展開。1月后觀察不同激素種類和濃度下莖段側(cè)芽萌發(fā)和成活情況。從表3可以看出，在誘導(dǎo)莖段側(cè)芽萌發(fā)的試驗(yàn)中BAI.O mg/L，附加IBAO.5 mg/L的長勢好，成活率最高，達(dá)68. 91%，萌發(fā)率也是最高，達(dá)79. 15%。因此，‘Y-I蘋果矮化砧木外植體初培過程中，最適合莖段側(cè)芽萌發(fā)的植物生長調(diào)節(jié)劑組合是BAI.O mg/L，附加IBAO.5 mg/L。

4 討論與結(jié)論

4.1 滅菌劑

‘Y-I'蘋果矮化砧木為多年生木本植物，生長在大田，附著在植物體上的菌類多且復(fù)雜，組織培養(yǎng)時(shí)不易消毒滅菌[11]。外植體消毒是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，不同滅菌劑對外植體的影響較大。正確選擇滅菌劑的種類可以降低污染率，減少組織死亡，提高外植體的成活率和萌發(fā)率[12] ，。在多種植物組織培養(yǎng)過程中，都用HgCI2來消毒，且效果較好[13]。而用次氯酸鈉雖然有一定的成活率，但污染率較高，這在本試驗(yàn)中進(jìn)一步得到了證明。從表1可以看出，綜合污染率、成活率和萌發(fā)率3個(gè)方面的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，HgCI2的滅菌效果要好于NaClO。0.1% HgCI2處理5 min，成活率最高，為66. 46%，而15%NaCIO處理為NaCl03個(gè)處理中成活率最高的，也只有58. 65%。，污染率隨著二者濃度的增高而下降，但同時(shí)萌發(fā)率也隨之下降。對比不同濃度HgClz和NaCIO的處理，以0.1%HgCl2濃度處理效果最好，成活率最高為66. 46%，同時(shí)污染率也不太高，為26. 73%，萌發(fā)率為74. 36%。因此，對于Y-I蘋果矮化砧木初培，選擇0.1% HgCI2處理5 min，效果最好。

4.2 取材時(shí)間

通常外植體的消毒效果因外植體采集時(shí)期不同而有所差異。因?yàn)橹参锷L具有明顯的季節(jié)周期性，不同的月份，因空氣溫度、濕度，光照時(shí)間等因素相差較大，直接影響到植物的生理狀態(tài)[14]。因此，外植體不同采集時(shí)間，長勢情況、菌類種類及累積等因素截然不同，必然會對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生重大的影響[15]。本試驗(yàn)通過不同取材時(shí)間對‘Y-1外植體滅菌效果的調(diào)查結(jié)果表明：當(dāng)5月份第一次取材時(shí)，其污染率僅為5.71%，顯著低于其它取材時(shí)間;就存活率而言，5月的成活率也顯著高于6、7、8月份的，其中5月5日取材的外植體存活率能達(dá)到65.45%。7月份之后外植體污染率明顯增高，8月的污染率高達(dá)75. 12%。這可能由于5月初，‘Y-I剛開始萌動不久，正值新梢生長旺盛期，還未完全木質(zhì)化，生命力強(qiáng)，枝條暴露在空中的時(shí)間較短;同時(shí)，本地春季少雨，空氣干燥。而隨著在空氣中暴露的時(shí)間增長，雨量的增大，外植體表面匯集的微生物越來越多，在滅菌時(shí)難以把表面的微生物殺死，導(dǎo)致污染率飆升。因此，5月初是‘Y-I蘋果矮化砧木最佳外植體取材時(shí)間。

4.3 植物生長調(diào)節(jié)劑

初代培養(yǎng)過程中芽的誘導(dǎo)率由植物生長調(diào)節(jié)劑尤其是細(xì)胞分裂素和生長素共同決定，只有在兩者的濃度配比都合適的情況下才能起到良好的誘導(dǎo)效果，當(dāng)細(xì)胞分裂素濃度高于生長素濃度時(shí)對芽的誘導(dǎo)有利[16，17]。因此，在組織培養(yǎng)中要根據(jù)外植體確定合理的生長調(diào)節(jié)劑配比。本試驗(yàn)以MS為基本培養(yǎng)基，通過不同濃度6- BA和IBA的使用表明：在誘導(dǎo)‘Y-1'莖段側(cè)芽萌發(fā)的試驗(yàn)中BA 1.O mg/L，附加IBA O.5 mg/l_的長勢好，成活率最高，達(dá)68. 91%，萌發(fā)率也是最高，達(dá)79. 15%。因此，‘Y-I蘋果矮化砧木外植體初培過程中，最適合莖段側(cè)芽萌發(fā)的植物生長調(diào)節(jié)劑組合是BA1.O mg/L，附加IBA O.5 mg/L。

通過‘Y-I蘋果矮化砧木外植體滅菌劑的篩選、采集時(shí)間的選擇、生長調(diào)節(jié)劑的調(diào)配，建立了‘Y-1蘋果矮化砧木初培的完整體系，為進(jìn)一步建立‘Y-I蘋果矮化砧木完整的組培快繁體系奠定了基礎(chǔ)。

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收稿日期：2019-10-24

基金項(xiàng)目：山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院特色農(nóng)業(yè)技術(shù)攻關(guān)項(xiàng)目支持：‘Y-I蘋果矮化砧木組織培養(yǎng)技術(shù)研究

作者簡介：王國平（1971 -）.男，副研究員，主要從事果樹無性繁殖技術(shù)研究。