血漿LOX-1及人外周血單核細胞LOX-1 mRNA表達水平與冠脈病變程度的相關性研究

左麗，周鵬

(1.成都醫學院第一附屬醫院心內科，2.衰老與血管穩態四川省高校重點實驗室，四川 成都 610500；3.川北醫學院第一附屬醫院心內科，四川 南充 637000)

冠心病(coronary heart disease，CHD)是我國近年來有增多的趨勢的常見病之一，其發生發展與動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)有很大關系，泡沫細胞的形成是動脈粥樣硬化形成、發展中的關鍵，其主要由血液中的單核細胞聚集黏附到血管內皮，轉變成巨噬細胞攝取氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)后轉變而成。Swamura等[1]于1997 年首先在牛主動脈內皮細胞上發現了血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1，LOX-1)，它是ox-LDL的細胞表面受體，能結合、吞噬、降解Ox-LDL，主要在內皮細胞上表達。其表達增加會促進單核源性巨噬細胞攝入ox-LDL，促使泡沫細胞形成，使粥樣核不斷增大，最終導致斑塊的破裂和急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)的形成。LOX-1在動脈粥樣硬化的發生發展的機制中可能起到重要作用。不同程度冠脈病變的患者血漿LOX-1和單核細胞的LOX-1mRNA的表達是否增高，它們之間是否存在相關關系，本研究將探討血漿LOX-1和LOX-1 mRNA的表達水平與冠脈病變中的可能機制及與冠脈病變嚴重程度的相關性。

1 材料與方法

1.1 對象和分組

入選2017年3月至2018年3月于成都醫學院第一附屬醫院心內科住院并首次接受冠脈造影的患者共156例，根據造影結果分為冠心病組(n=113)及排除冠心病的對照組(n=43)，冠心病組再計算SYNTAX評分，根據評分結果分為：低分組0～22分(39例)；中分組23～32分(41例)；高分組≥33分(33例)。SYNTAX評分是基于2008年的SYNTAX研究[2]上產生的一種評分工具，是根據冠狀動脈造影(coronary angiography，CAG)的影像學結果對病變嚴重程度進行評分，根據評分結果分為：低分組0～22分，中分組23～32分，高分組33分以上。分數越高代表病變程度越重，風險越高。許多研究顯示[3-5]，SYNTAX評分不僅可以作為復雜冠脈疾病的風險分層工具，也可以預測復雜冠脈病變患者的臨床預后，是目前較先進的危險分層工具。

1.2 主要試劑

人LOX-1 ELISA 試劑盒購于武漢BOSTER公司，RNAiso PLUS(Total RNA提取試劑)、SYBR Premix Ex TaqTM II、(Tli RNaseH Plus) 逆轉錄試劑盒、淋巴細胞分離液購于寶生物工程(大連)有限公司，2×Tag PCR MasterMix購于美國 Gibco 公司，2 000 bp DNA LANDDER購于中國北京天根生化科技有限公司，LOX-1上下游引物及ACTIN-B上下游引物均由BIONEER公司設計及合成。

1.3 觀察指標及檢測方法

采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定測定血漿中LOX-1，采用熒光聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測外周單核細胞LOX-1 mRNA的表達水平。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 兩組臨床指標的比較分析

(1)一般臨床指標比較顯示：研究對象的性別、年齡、是否合并高血壓、是否合并糖尿病、吸煙與否、TG、VLDL以及HLDL的差異均無統計學意義(P>0.05)。TC、LDLC之間的差別有統計學意義(P<0.05)(表1)；(2)冠心病與對照組之間的比較分析：冠心病組與對照組的LOX-1、外周血單核細胞LOX-1mRNA表達的比較，冠心病組患者血漿LOX-1水平以及外周血單核細胞LOX-1mRNA的表達均較正常對照組高，其差異有統計學意義(P<0.01)(表2，圖1-圖2)；(3)冠心病各組與正常組的比較：高分組LOX-1、LOX-1 mRNA表達較中分組、低分組和對照組均高；中分組LOX-1、LOX-1 mRNA的表達較低分組和對照組高；低分組LOX-1、LOX-1 mRNA的表達較對照組高，差異均有統計學意義(P<0.05)(表3，圖3-圖4)。

表1 兩組臨床指標的比較±s)

*P<0.05，與對照組比較。

表2 冠心病組與對照組LOX-1、外周血單核細胞LOX-1mRNA水平比較±s)

*P<0.05，與對照組比較。

表3冠心病各組及對照組間血漿LOX-1、hs-CRP、和外周血單核細胞LOX-1mRNA水平比較

指標對照組(n=43)低分組(n=39)中分組(n=41)高分組(n=33)LOX-1mRNA0.286±0.7740.318±0.450?0.349±0.057#?0.421±0.069#?△LOX(pg/mL)104.712±14.850108.967±4.00?113.694±5.125#?118.398±3.829#?△

*P<0.05，與對照組比較；#P<0.05，與低分組比較；△P<0.05，與中分組比較。

2.2 冠心病LOX-1、外周血單核細胞LOX-1mRNA的相關性分析

冠心病LOX-1、外周血單核細胞LOX-1mRNA的相關性分析(圖5)。 以SYNTAX評分為應變量，LOX-1、LOX-1mRNA的表達與其呈正相關(表4)，LOX-1、LOX-1mRNA是其獨立影響因素(表5)。

表4冠心病組SYNTAX評分與兩者的關分析

指標r值P值LOX-10.620<0.01LOX-1mRNA表達0.560<0.01

表5 SYNTAX評分與兩者的多元逐步回歸分析

3 討論

Murohara等[6-7]研究發現ox-LDL在AS的發生發展起重要作用，它通過促使單核細胞黏附、促使泡沫細胞形成、刺激內皮細胞釋放氧化自由基[8-9]等多種加速AS形成發展。LOX-1作為ox-LDL主要受體，能夠吞噬、降解ox-LDL。正常的生理狀態下LOX-1的表達量很少[10-11]，而在高血壓、高脂血癥等病理狀態下，其表達水平可明顯提高[12-13]。目前的研究認為可溶性LOX-1可與血液循環中的ox-LDL結合，可減少其與膜蛋白結合的機會，從而減少其對內皮細胞的損傷作用[14]。血液循環中可溶性LOX-1的水平升高，可反映細胞LOX-1表達水平升高。

本研究結果顯示冠心病組與對照組臨床資料比較，研究對象的性別、年齡、是否合并高血壓、是否合并糖尿病、吸煙與否的差異均無統計學意義，說明兩組間具有可比性。本研究結果還顯示血清LOX-1與人外周血單核細胞中LOX-1 mRNA在冠心病患者中呈高表達并且兩者隨冠狀動脈病變嚴重程度的增高而增高。多元回歸分析顯示LOX-1和單核細胞LOX-1mRNA均可作為冠脈病變嚴重程度獨立影響因素。本研究與國內外的一些相關研究[15-17]結果一致，均顯示LOX-1蛋白及基因的表達水平是冠脈病變程度的獨立影響因素。朱慧蓮等[18-19]研究用不同濃度的ox-LDL與內皮細胞一起培養，結果證明ox-LDL可通過濃度、劑量依賴的方式上調LOX-1以及LOX-1mRNA的表達。在 Inoue 等[20]在apoE 基因敲除小鼠的研究中發現，ox-LDL可通過LOX-1誘導各種炎癥因子和黏附分子的表達，促進單核細胞在血管內皮的黏附聚集，加速AS的發展。在本研究結果也顯示LOX-1和單核細胞LOX-1mRNA的表達均在冠心病患者中的表達與隨冠脈病變程度的增高而增高，且兩者相互之間呈正相關，LOX-1蛋白及基因的表達水平是冠脈病變程度的獨立影響因素。因此，可以推測在AS發生發展的早期，外周血中被氧化修飾的LDL濃度增多，可誘導LOX-1及其基因的表達上調。一方面，細胞上的LOX-1受體的增加可使血漿中可溶性的LOX-1隨之增加，作為清道夫受體清除血液中的ox-LDL，發揮保護血管內皮的作用；另一方面，LOX-1受體的表達增加會加速單核細胞在血管內皮的黏附、聚集，從而進一步導致血管內皮的損傷。Mehta等[21]研究發現阿司匹林可干預LOX-1表達，并且可能通過LOX-1途徑抑制血管內皮細胞炎癥反應。Li 等[22]研究以及國內的研究報道[23]他汀類藥物能夠下調內皮細胞LOX-1的表達，降低ox-LDL誘導的細胞黏附分子表達。

綜上，增加血漿中LOX-1的水平和下調LOX-1mRNA的表達可以延緩AS發展過程，起到血管保護的作用。因此，在進一步的實驗中，可以通過觀察在不同濃度的LOX-1和加入LOX-1mRNA抑制劑作用下的細胞表達水平變化進一步證實猜想。LOX-1、單核細胞LOX-1mRNA表達可作為臨床上預測冠狀動脈病變程度的指標，并可為成為冠心病的研究提供新方向。