髓系觸發受體-1的拮抗劑對大鼠腸巨噬細胞超微結構的影響

盛竹鴿，郭劍，梁愛玲，王宇暉，朱浪潮，王瑩，劉利平

(渭南市中心醫院消化內科，陜西 渭南 714000)

腸道是人體中最大的內毒素、細菌貯存庫，可通過體液免疫和細胞免疫共同防御各種有害因素對機體的侵犯，特別是腸黏膜屏障可有效防止腸腔內多種有害物質穿越腸黏膜進入血液循環，引起其他組織器官損傷[1-2]。腸道巨噬細胞是腸黏膜屏障重要的組成部分，源于骨髓中造血干細胞，主要存在于腸上皮下的固有層中，可參與機體固有免疫反應，具有殺傷及吞噬功能[3-4]。在病理狀態下，腸道巨噬細胞可釋放大量的炎癥因子，可以進入血循環，作用于肝、肺、腎等器官組織并引起損傷[5]。特別是脂多糖(LPS)可以與細胞表面受體結合而激活這一途徑，影響腸黏膜屏障通透性，造成腸屏障功能障礙[6-7]。髓系細胞觸發受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)是當前發現的細胞表面分子，是選擇性表達在CD14+單核細胞及中性粒細胞等髓系細胞表面的炎癥受體，可參與促炎因子的合成釋放，能夠放大炎癥的級聯反應[8-9]。17個氨基酸組成的多肽(LP17)是TREM-1拮抗劑，含有TREM-1天然的CDR2、CDR3序列的至少3個氨基酸，可減少炎癥介質的釋放[10-11]。本研究采用LPS體外刺激腸巨噬細胞，應用TREM-1拮抗劑-LP17來干預腸巨噬細胞內TREM-1的表達，探討TREM-1的拮抗劑對大鼠腸巨噬細胞超微結構的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康雄性SD大鼠由本院動物實驗動心提供，質量0.2～0.25 kg，實驗符合動物倫理要求，批準號：[SCXK()2012-0004]，9周齡，實驗前予以禁食12 h、禁水4 h，保持腸道清潔。 LP17多肽由上海潔而生化合成，LPS購自美國sigma公司。RPMI-1640培養基、FBS購自美國Hyelone公司；細胞培養板購自美國Corning公司。

1.2 大鼠腸巨噬細胞的分離培養與鑒定

大鼠用尾靜脈注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉。選擇腹部正中切口，顯露全部小腸，沿系膜快速切取全部小腸，PBS沖洗腸管，沿小腸系膜縱向分段剖開，用Hanks平衡鹽溶液，振蕩培養60 min后采用用膠原酶Ⅳ繼續消化2 h，不銹鋼400目篩網進行過濾，1 500 rpm 4 ℃ 離心20 min收集細胞。 計數大腸巨噬細胞，以RPMI1 640培養基進行分離培養。采用一抗Rabbit polyclonal to CD14(1∶300)進行鑒定分析，二抗為Goat anti—Rabbit IgG(H+L)，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，陽性信號為綠色熒光。

1.3 大鼠腸巨噬細胞的分組處理

大鼠腸巨噬細胞分為3組，對照組：未加LPS 和LP17；LPS組：LPS給藥濃度為1 mg/L；治療組：LPS給藥濃度為1 mg/L，LP17給藥濃度為0.1 mg/L。

1.4 MTT法檢測細胞活力

將分離好的大鼠腸巨噬細胞按照2×104個細胞的接種密度接種至96孔板中，生長到對數生長期進行上述處理，每個濃度3個復孔。培養48 h后每孔加入20 μL MTT溶液，繼續培養4 h，加入二甲基亞砜后進行震蕩10 min，采用酶標儀在490 nm處測定各孔的吸光值(OD值)，計算細胞活力。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

收集處理48 h后的大鼠腸巨噬細胞，采用預冰冷70%的乙醇固定，使用PBS重懸5 min，400目篩網過濾。然后4 ℃避光30 min，流式細胞儀檢測與計算細胞凋亡情況。

1.6 Western blot檢測細胞TREM-1和TNF-α表達

收集處理48 h后的大鼠腸巨噬細胞，提出總蛋白，用Western blot檢測TREM-1和TNF-α 蛋白表達。

1.7 電鏡觀察細胞超微結構

收集處理48 h后的大鼠腸巨噬細胞，經2.5% 戊二醛前固定2 h，再經常規脫水、透明、樹脂浸透包埋，制成70 nm切片組織，經檸檬酸鉛染色后在透射電鏡上觀察拍照。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 細胞分離培養、鑒定及活力比較

大鼠腸巨噬細胞生長狀態良好，免疫熒光顯示為綠色熒光，CD14表達陽性，細胞分布較均勻，見圖1。治療組與對照組的細胞活力指數顯著高于LPS組(P<0.05)，治療組與對照組對比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組大鼠腸巨噬細胞活力指數比較

*P<0.05，與LPS組比較。

2.2 細胞凋亡指數比較

治療組與對照組的細胞凋亡指數顯著低于LPS組(P<0.05)，治療組與對照組對比差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組大鼠腸巨噬細胞凋亡指數對比

組別n細胞凋亡指數(x-±s)對照組32.19±0.22LPS組321.43±1.83治療組33.28±0.84

*P<0.05，與LPS組比較。

2.3 TREM-1、TNF-α的表達

治療組與對照組的TREM-1、TNF-α相對表達量顯著低于LPS組(P<0.05)，治療組與對照組對比差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.4 細胞超微結構對比

電鏡下觀察對照組腸微絨毛整齊排列，巨噬細胞形態規則；LPS組發現腸巨噬細胞內出現大量凋亡小體，巨噬細胞體積增大，突起，胞間連接紊亂斷裂；治療組發現腸巨噬細胞內出現邵愛玲凋亡小體，腸上皮細胞間隙恢復正常，巨噬細胞表面突起、偽足少。見圖3。

3 討論

腸黏膜中腸巨噬細胞、樹突狀細胞構成了腸道防止感染的重要防線，在腸黏膜屏障中占重要作用，確保保護性免疫反應[12]。在機體損傷與發生感染時，可出現腸黏膜上皮水腫，產生大量酸性代謝產物，細胞間連接斷裂，使腸黏膜血管舒縮紊亂，進一步損傷腸黏膜上皮。特別是腸巨噬細胞的活化可產生大量促炎因子，形成炎癥級聯放大反應，引起腸黏膜通透性增加[13]。

巨噬細胞在先天性免疫、腫瘤、炎癥中發揮重要作用，其在炎癥反應早期階段可起到吞噬細菌及殺滅抗原的作用，也在腫瘤的形成中有一定促進作用[14]。LPS可引起黏膜下水腫，腸上皮絨毛出現壞死，通透性增加，血流量減少，并可誘導炎癥因子等釋放，引起腸黏膜屏障損傷[15]。LP17為TREM-1特異性拮抗劑，可有效阻斷感染性休克模型大鼠TREM-1通路，并顯著減輕腸屏障的通透性[16]。本研究顯示治療組與對照組的細胞活力指數顯著高于LPS組(P<0.05)，細胞凋亡指數顯著低于LPS組(P<0.05)，治療組與對照組對比差異無統計學意義(P>0.05)，表明大量過度激活的腸巨噬細胞對腸黏膜屏障是有害的，LP17的應用能促進恢復細胞活力，降低細胞凋亡水平。不過也有研究表明LP17并不能完全阻斷細胞因子的產生，不影響其他免疫系統的能力[17-18]。但大部分研究已經證明LP17 是與TREM-1結構相似的合成肽，可競爭性阻斷TREM-1信號，提高膿毒血癥模型小鼠的生存率，一定程度上減少腸巨噬細胞凋亡，降低在炎癥環境下腸黏膜損害的程度，發揮腸道保護作用[19]。

腸道巨噬細胞是腸道保護性免疫的重要組成部分，具有維持腸道微生物穩定等作用；其在不同的條件下表現出不同的免疫表型，具有分泌、吞噬細胞因子等功能，并能放大炎癥反應[20]?；罨蟮木奘杉毎梢院铣煞置诎═NF-α素在內的多種細胞因子，并可循環促進炎癥反應的發生，形成級聯反應[21]。TREM-1為跨膜糖蛋白，由 234 個氨基酸組成，相對分子量為30 KD。TREM-1能進一步增強Toll樣受體所介導的炎癥反應，同時增加炎性細胞的細胞因子。TREM-1也可識別到不同病原微生物或宿主所產生的危險信號，并引起機體產生免疫應答，誘導細胞因子、趨化因子等的產生，在代謝、炎癥、病原體反應及組織損傷和修復中發揮重要作用，也可進一步清除病原微生物[22]。TREM-1在中性粒細胞表達與膿毒癥的嚴重程度有關，TREM-1+中性粒細胞計數分別與SAP大鼠病理評分、血清淀粉酶的水平和促炎性細胞因子的水平正相關。本研究顯示治療組與對照組的TREM-1、TNF-α相對表達量顯著低于LPS組(P<0.05)，治療組與對照組對比差異無統計學意義(P>0.05)。相關研究也表明LP17在大鼠膿毒癥模型可通過阻斷與TREM-1誘餌受體相互作用，可減少炎癥介質的釋放，可防止大鼠器官功能衰竭；LP17也能能夠減輕結腸的炎癥反應，從而降低小鼠結腸炎的嚴重性[23]。

雖然對于TREM-1阻斷可降低炎癥的研究已經逐步涉及，但對于TREM-1分子的上下游信號通路及其調控機制的研究還不夠清楚。TREM-1和TREM 受體表達在各種髓系細胞中，能夠誘導多種炎癥介質產生。通過對抗TREM-1抗體在單核細胞上的競爭性抑制，可誘發細胞內鈣離子轉移，使促炎性細胞因子及共同刺激因子的產生，放大陽性反應[24]。不過TREM-1激活后的信號通路并未完全明確，目前研究表明TREM-1可活化下游信號通路，促進細胞合成促炎因子[25]。因此關于TREM-1激活在巨噬細胞炎癥中的作用機制還有待進一步研究。

總之，TREM-1特異性拮抗劑LP17能有效提高細胞活力，減少巨噬細胞凋亡，抑制巨噬細胞TREM-1與TNF-α的表達，有望成為治療腸屏障功能障礙的新靶點。