脾腎虧虛型重癥肌無力患者血清miRNA表達差異的初步研究

姜 超，王 婷，徐中菊

(1西安醫學院第二附屬醫院神經內科,陜西 西安710038；2上海中醫藥大學附屬龍華醫院,上海200032；3西安醫學院第二附屬醫院信息科,陜西 西安710038；4上海浦南醫院,上海200125)

0 引言

目前,關于miRNA與免疫系統相關性的研究報道日益引起人們的重視,相對于臨床上容易獲得的血清樣本,我們有理由相信,對獲得與免疫系統疾病發病、進展或臨床治療緊密關聯的血清miRNA進行深入地相關研究無疑是目前很好的思路。迄今為止,關于miRNA和重癥肌無力(myasthenia gravis,MG)之間可能的關系鮮有報道。已知MG是一種典型的依賴T細胞且B細胞介導的自身免疫性疾病,雖然對于其發病機制的探索一直從未停止,但和其他的自身免疫性疾病一樣,對于觸發其發病的源頭依然不是很清楚。在中醫上,對MG尚無完備記載,但從其病機和臨床表現分析,當屬虛損之“痿證”范疇,結合我們前期研究發現,其病位可主要定于脾腎［1－2］。那么,基于病癥結合的理論指導去深入分析脾腎虧虛型(spleen and kidney deficiency type,SKDT)MG血清miRNA表達的相關研究對于未來探索新的治療MG的方法很有意義,值得進一步深入研究。

1 資料和方法

1.1 臨床病例來源研究的34例MG患者來源于2010年11月至2012年4月上海中醫藥大學附屬龍華醫院以及遼寧中醫藥大學附屬醫院門診,全部符合本研究納入標準。患者年齡為14～75歲。受試者被告知,自愿簽署知情同意書。西醫診斷標準：符合MG基本診斷標準［3］,包括重復刺激神經肌肉傳遞障礙的肌電圖模式的波動性,肌無力癥狀支持,為改良OssemanⅠ型,ⅡA型、ⅡB型。中醫診斷標準：符合中醫痿證基本診斷標準［4］。凡具備主證1項和次證1項以上,或兼見舌苔脈象即可。排除標準如下：①Osseman方案Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型者。②家族性MG,先天性MG綜合證及藥物(青霉胺、α-干擾素等)所致MG。③妊娠或哺乳期婦女。④有合并證的疾病,如腦血管疾病、腎功能不全、造血系統疾病、精神疾病的患者。⑤過敏體質(對2種以上食物或藥物過敏者)。⑥近1個月內參加過其他藥物臨床試驗。⑦近3個月內曾靜脈應用丙種球蛋白或行血漿置換治療的患者。按照排除標準進行排除。本研究由龍華醫院的倫理審查委員會批準,并獲得所有參與研究的書面許可。

1.2 血清樣本的收集和處理①對每名研究對象采用非抗凝真空采血管空腹采集血液樣品6 mL；②血樣采集完畢后,盡快(1 h內)室溫下普通離心機3500 rpm/min,離心5 min；③可見上層血清,將上層血清小心取出,分裝至滅菌凍存管中并標記,置于－80℃冰箱中儲存備用。④進行樣本簡要信息記錄,包括樣本編號、研究對象一般資料,病史材料、CRF表填寫。

1.3 總miRNA的提取及純化采用TRIzol Reagent和mirVanaTMmiRNA Isolation Kit對血清miRNA進行提取、分離。抽提過程參照試劑盒(mirVana RNA Isolation Kit-Applied Biosystem p/n AM1560)說明規范進行。

1.4 芯片檢測miRNA干冰運輸送到上海豪伯生物技術有限公司進行Agilent人類miRNA array雜交(v.12.0)。每個芯片雜交標記Cy3或Cy5的單個樣品。按照背景減法和規范進行。miRNA芯片質量控制標準：2100 RIN＞＝6.0且28S/18S＞＝0.7,通過后才可以進行下一階段研究。

1.5 數據收集處理和統計學方法分析實驗結果運用使用2－ΔΔCT法測定了各組細胞中miRNA的相對表達水平。

計算公式：ΔCt＝檢測基因 Ct值的平均值－管家基因(U6 snRNA)Ct值得平均值。ΔΔCt＝待測組ΔCt－對照組 ΔCt。 因此待測基因的表達量由 2－ΔΔCt來進行計算。結果表示miRNA在MG患者于正常人表達倍數。

1.6 統計分析臨床樣本統計分析使用Mann-Whitney檢驗,以評估不同分組之間的統計學意義。每個實驗數據表示為±s。統計分使用Graphpad 5.0軟件繪圖,P＜0.05表示差異無統計學意義。數據均平行3次取平均值。

2 結果

2.1 入組患者的一般資料比較SKDT-MG患者中女18例,男16例,年齡17～75歲,平均48.70歲；正常人群中女5例,男5例,年齡20～70歲,平均46.5歲。兩組人群年齡、性別構成比均衡,具有可比性(P＞0.05,表 1)。

表1 入組病例性別、年齡分布組間比較(例)

2.2 總RNA的純度分析和質量檢測Agilent miRNA芯片質控標準：RIN＞＝6.0且28S/18S＞0.7。抽提的RNA質量符合質控要求,可進行芯片雜交實驗(表2)。

表2 抽提的RNA質量合格樣本

2.3 MG組較正常組差異表達的miRNA篩選由于芯片檢測過程中,每組僅有3張芯片,重復隨機樣本數量較少難以達到標準正態分布。為了減少小樣本造成的差異篩選誤,利用隨機方差模型(random variance model,RVM)修正的F檢驗計算差異,檢驗計算差異miRNA間差異的顯著性水平(P-value)和誤判率(FDR),從而得到差異miRNA。治療前,使用RVM對MG組和正常人組的差異性miRNA進行分析發現,總共篩選到43個差異性miRNA(差異倍數大于2倍),其中MG組較正常人組上調的miRNA有21個(表3),下調的miRNA有22個(表4)。采用Cluster 3.0和TreeView programs對差異表達的數據進行聚類分析,并制作熱圖(圖1)。

表3 MG組較正常組表達上調的miRNA

表4 MG組較正常組表達下調的miRNA

圖1 MG組較正常組差異表達miRNA聚類分析熱圖

3 討論

MG是一種抗體介導,神經肌肉接頭傳遞的慢性疾病,發病率為每年8/10萬～20/10萬人,其靶點是突觸后蛋白,主要涉及骨骼肌乙酰膽堿膽堿受體(AchR)和特定肌肉的酪氨酸激酶［5－6］。 研究［6］認為,遺傳因素在MG發病中發揮了重要作用。此外,病毒或細菌感染,如脊髓灰質炎病毒和大腸桿菌,也可能參與了MG的發病［7－8］。然而,目前還沒有任何報告可以非常清楚地闡明其基本發病機制,現存的僅是一些公認的假說,MG復雜疾病的發病機制,已經嚴重阻礙了我們對疾病發生發展的理解,從而延緩了對易感個體的識別和治療。該病的主要臨床特征是骨骼肌無力癥狀的波動性。目前,抗膽堿酯酶藥、非特異性的免疫抑制劑、胸腺切除術和血漿置換仍然是治療MG的主要方法［9－11］。不幸的是,上面所言及的治療措施具有一些嚴重的副作用,如心律失常、骨質疏松癥和低血壓,并不能抑制患者癥狀的復發,而達到完全緩解［12］。顯然,有必要去更深入地探討MG發病機制,尋求具有較高療效和較少副作用的替代治療MG的措施,這無疑成為研究的一個熱點。中國傳統醫藥(Traditional Chinese Medicine,TCM)由于其長期的療效性以及較少的副作用,已經被用來治療許多疾病,包括癌癥、心血管疾病、炎癥和 MG 疾病［13－17］。

MicroRNAs(miRNA)(19～22個核苷酸長)是一種小非編碼RNA,其介導靶基因的轉錄沉默。在動物中,miRNA通常在靶基因3′非翻譯區(UTR)的互補位點結合,并調節靶基因的表達,無論是翻譯抑制,mRNAs的降解,或者兩者全部［18］。自從 miRNA的發現,學者們就一直致力于確定miRNA及其相關的疾病生物學功能。miRNA的失調一直伴隨著人類的某些疾病,如白血病和心臟疾病［19－20］。 在腫瘤發生及轉移中,miRNA作為一個重要因素的出現,他們的表達特征與慢性淋巴細胞性白血病、肺癌的預后和進展相關［21－22］。

生物信息學是最近興起的一門將生物學、醫學、信息學等學科交叉銜接起來的學科,目的是通過信息學的技術手段解決生命科學問題。生物信息學以其快速、方便、準確、靈活的特點正在生－命科學研究中發揮著重要作用。在miRNA研究領域也不例外,從miRNA研究的最開始到現在,生物信息學都發揮著至關重要的作用,生物信息學在miRNA識別、miRNA靶基因預測、miRNA功能分析、miRNA關聯疾病分析、miRNA上游轉錄調控分析,SNP分析以及miRNA-藥物相互作用分析等領域發揮著不可替代的作用,并得到越來越多的應用。

本研究采用了Agilen公司的miRNAs芯片產品,其具有特殊的芯片生產工藝,所以實驗檢測的靈敏度得到了極大的提高,且簡化了操作步驟。同時不需要將總RNA純化或者濃縮就可特異性檢測出成熟的miRNA,這樣就會大大避免濃縮或純化總RNA的過程中造成miRNA損失帶來的檢測誤差。因為芯片雜交數據的可靠性會受到芯片探針數目、樣品質量、檢測靈敏度等因素的影響,所以我們在數據分析前首先對原始數據進行篩選。且芯片雜交的熒光信號值需達到一定值才可認定其探針雜交信號有效,即芯片信號在掃描后會去掉假陽性或假陰性信號,從而提高芯片檢測結果的準確性。同時為了消除不同芯片所帶來的系統誤差,會將樣品檢測結果的所有原始數據都進行中位數分析,再進行數據分析。最后,只有檢測出有效信號值的miRNA才能進入下一步分析。因為芯片技術具有高通量的特點,所以會產生巨大的數據信息。高水平的數據分析不僅可以為我們找到一些重要的發現,同時還能發掘出更多的生物學信息,為我們的進一步研究提供準確的信息。所以對于高通量實驗設計特別是芯片檢測實驗,數據分析決定了芯片實驗的成功與否。在本試驗中,我們判斷兩個樣本校正后數據是否存在差異,主要是通過差異倍數和P值,只有當P＜0.05且差異倍數大于2時,我們才認定其差異有統計學意義,對于無法進行生物學統計的數據,我們則采取差異倍數大于2的標準,這些都是符合了一般數據處理標準。然而,由于存在儀器檢測靈敏度、效率以及樣本質量等因素,那么對于設定嚴格標準去篩選miRNA,仍需要大樣本進一步研究驗證后才能真正確定其客觀的科學性和準確性。

本試驗運用miRNA芯片技術對正常人和MG患者的血21條,顯著表達下調的有22條。采用Cluster3.0和TreeView programs對差異表達的數據進行聚類分析。根據已篩選出的差異miRNA,進一步篩選出MG組的miRNA表達差異。并結合中醫傳統理論分型,初步證明SKDT-MG患者血清存在著確切的差異性miRNA表達譜,參考國內外最新的文獻報道,依據篩選的血清miRNA表達量的高低,進一步選擇特異性的血清miRNA予以驗證。那么,基于外周血清miRNA的差異性表達以及中醫藥傳統理論對于疾病分型,進一步探索SKDT-MG的發病機制,研究通過血清miRNA信號途徑干預SKDT-MG的臨床作用機制,盡早地對MG進行有效診斷干預,無疑具有重要的臨床和科研意義。