不同侵襲性膀胱癌患者預后與基因差異表達研究4

韓耕宇，李華福，許 宸，謝 群

(1珠海市人民醫院泌尿外科,廣東 珠海519000；2中山大學附屬第七醫院,廣東 深圳518102)

0 引言

膀胱癌作為全球第九大惡性腫瘤,每年有超過430 000新發人群［1］。在歐洲,同年發生的膀胱癌新發人群有118 000,每年死亡人數達到 52 000［2］。而在美國,每年有超過70 980新發人群,每年死亡人數達到14 330［3］。75%的初發膀胱癌中有75%的患者為非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC),主要治療手段包括經尿道電切術(transuretheral resection,TUR)和膀胱灌注治療；還有25%的初發膀胱癌患者為非肌層浸潤性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC),主要治療手段為膀胱癌根治術(radical cystectomy,RC)［4］。 NMIBC容易復發和進展,而MIBC則更容易發生轉移從而影響預后。MIBC行RC后其腫瘤特異死亡率仍為50%～70%［5］。 NMIBC 5年復發率為 30%～80%,進展率為1%～45%［6］。雖然腫瘤的分級、分期對膀胱癌的治療與預后評估起重要作用,但這些指標尚不能完全反映該腫瘤的生物學特性。不同侵襲性膀胱癌患者的生物學特征存在差異,這些差異可能是由不同基因的表達以及突變所引起。膀胱癌是一種多基因相關腫瘤,在機體內在因素與外在因素的聯合作用下導致了膀胱癌的發生,是由細胞中基因的改變并積累而逐步形成的,細胞的癌變是一個十分復雜的過程［7］。分子生物學層面,膀胱癌變機制主要涉及癌基因激活及過度表達、抑癌基因突變及缺失、修復功能相關基因的功能喪失、在基因組中出現了核苷酸異常的串聯重復,微衛星不穩定、調控信號傳導通路的功能紊亂、細胞端粒酶過度表達、細胞凋亡機制發生障礙以及出現浸潤轉移等相關分子事件［8］。而出現浸潤轉移等相關分子事件可能與不同侵襲性膀胱癌相關,一些研究也發現某些基因在NMIBC中發生基因丟失的概率明顯低于浸潤性膀胱癌,故認為膀胱腫瘤的侵襲性可能與這些有著密切關系［9］。

探討不同侵襲性膀胱癌患者基因差異表達,能夠為我們明確兩者的生物學特征,對靶向治療以及診斷具有重要的意義。因此本研究通過比較不同侵襲性膀胱癌患者的組織腫瘤細胞預后和基因表達譜,篩選與不同侵襲性膀胱癌患者相關的差異表達基因,并分析其涉及的關鍵通路,為尋找更準確、簡便、實用的生物標記,鑒別診斷和指導個體化治療提供新思路。

1 材料和方法

基因表達譜數據來源于基因表達綜合數據庫(GEO,Gene Expression Omnibus,http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)［10］。 材料為膀胱癌組織,分離單個腫瘤細胞。采用Illumina公司出品的Illumina human-6 v2.0 expression beadchip生物芯片。GEO登陸號為 GSE13507［11］。 由 Seon-Kyu Kim 等提交,包括103例NMIBC患者,62例MIBC患者標本。

采用GEO數據庫的GEO2R在線分析工具進行差異表達基因分析(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)。該工具基于R程序語言,利用R語言中GEOquery和limma程序包,應用t檢驗篩選差異表達基因［12］。基因表達譜數據具有高維度(檢測的基因數非常多,通常幾千甚至上萬)和小樣本量的特點,需要多重假設檢驗(Multiple test)控制。本研究中多重假設檢驗控制采用 Benjamini和Hochberg提出的假陽性率控制法［13］。差異基因篩選標準：P＜0.05,校正P值(adjustedP-value)＜0.05,基因表達值倍數變化(fold change,FC)≥1.5。最后通過信噪比(scalable profile,SNP)的差異進行排序,用 pearson相關分析生成聚類分析熱圖,并用R語言進行熱圖繪制。

利用UniHI數據庫(Unified Human Interactome database,http：//www.unihi.org/)找出與之能發生相互作用的蛋白質［14］。分析其所編碼的蛋白之間的相互作用,然后在線作圖,刪除與其它蛋白無相互作用的節點后,調整圖中節點位置以充分暴露其互作網絡形態,繪制差異基因互作網絡圖。

GEO數據庫膀胱癌患者的隨訪資料提供下載MINiML formatted family file(s)數據,并使用SPSS17.0軟件進行統計學分析。采用Kaplan-Meier法計算總體生存率(overall survival,OS)和腫瘤特異死亡率(cancer specific mortality,csm),Log-Rank法比較OS的差異。不同分組的頻率分布和臨床病理特點采用Pearson's chisquare檢驗。患者的一般情況見表1。

表1 NMIBC患者與MIBC患者一般情況

2 結果

NMIBC 患者1、3、5年 OS分別為90.3%、81.5%、72.19%；MIBC患者 1、3、5年 OS分別為 82.7%、49.1%、38.3%。兩組患者OS比較,差異有統計學意義(P＜0.001),NMIBC的OS優于MIBC患者(圖1)。NMIBC患者 1、3、5年 CSM 分別為 97.9%、96.3%、95.4%；MIBC 患者 1、3、5年 OS分別為 85.8%、55.7%、43.4%。兩組患者CSM差異有統計學意義(P＜0.001),NMIBC的CSM優于MIBC患者(圖2)。

圖1 NMIBC與MIBC OS對比

圖2 NMIBC與MIBC CSM對比

NMIBC對比MIBC患者基因差異表達中上調有17個,下調基因 8個(圖 3)。下調的基因包括S100A8、ACTG2、CALD1、FLNC、ATF3、MT2A、SLC2A3以及CTGF。上調的基因包括 ST3GAL5、CRTAC1、TESC、TMPRSS4、D4S234E、BTBD16、C10ORF99、CTSE、 LOC644844、 SPOCD1、 ANXA10、 SLC14A1、HSD17B2、KRT13、SYT8、FABP4 以及 HS.580308。

圖3 NMIBC對比MIBC患者基因差異表達熱圖

NMIBC對比MIBC差異表達基因中上調有17個基因構建蛋白質相互作用網絡,除去孤立無互作的蛋白節點,篩選出4個上調基因編碼的蛋白質具有相互作用關系,基因圓圈大小代表該基因的影響分數,作用的大小以Interaction大小表示由圖4可知ATF3基因、CTGF基因、MT2A基因以及SLC2A3發揮重要的作用。NMIBC對比MIBC差異表達基因中下調有8個基因構建蛋白質相互作用網絡,除去孤立無互作的蛋白節點,篩選出2個下調基因編碼的蛋白質具有相互作用關系,基因圓圈大小代表該基因的影響分數,作用的大小以Interaction大小表示,由圖5可知HSD17B2基因和FABP4基因發揮重要的作用。

圖4 上調基因編碼的蛋白質相互作用圖

圖5 下調基因編碼的蛋白質相互作用圖

3 討論

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤,其中肌層浸潤型膀胱癌易遠處轉移,預后較差。多種復雜分子機制參與膀胱癌的侵襲、轉移過程。腫瘤侵襲是各種腫瘤發展的重要過程,在膀胱移行細胞癌,癌細胞侵入肌層、血管或膀胱周圍組織的情況與膀胱癌的局部復發、轉移和預后密切相關。一些蛋白質可通過調控腫瘤細胞的生長、遷移、黏附、凋亡或腫瘤免疫等途徑影響腫瘤細胞的惡性程度、侵襲和轉移能力。所以,通過比較不同惡性程度的膀胱癌細胞系之間蛋白質組的差異,可以發現一些與膀胱癌惡性程度相關的特異性蛋白質,深入了解這些蛋白質的功能,將有利于促進膀胱腫瘤診斷和治療的研究以及新藥物的開發。本研究利用基因表達綜合數據庫(GEO)獲得包括 103例NMIBC患者和62例MIBC患者標本,進行差異表達基因分析、生存預后分析以及GSEA基因富集分析,發現NMIBC的CSM優于MIBC患者,篩選出4個上調基因(ATF3基因、CTGF基因、MT2A基因以及SLC2A3)編碼的蛋白質具有相互作用關系,篩選出2個下調基因(HSD17B2基因和FABP4基因)編碼的蛋白質具有相互作用關系。

早期發現膀胱癌的侵襲性是臨床的一大挑戰,大量的基于基因方面的研究希望能夠發現能夠早期預測膀胱癌侵襲性的基因或者標志物,但是都存在一定的局限性［15］。本研究發現 NMIBC對比 MIBC差異表達基因中上調的基因中,ATF3基因、CTGF基因、MT2A基因以及SLC2A3具有重要意義；下調的基因中,HSD17B2基因和FABP4基因具有重要意義。

ATF3基因(轉錄激活因子3)在正常靜息的細胞中表現為穩態表達,mRNA的基礎水平非常低,在體外培養的細胞中,ATF3基因可被細胞因子、生長刺激因子、病毒蛋白和信號分子誘導表達［16］。一些研究表明,ATF3基因在轉錄調控、細胞凋亡和細胞周期進展中扮演重要角色,在多種腫瘤中呈高表達,促進腫瘤的發生發展、侵襲轉移,但其中的機制并不清楚［17］。 臧盛兵［18］等通過研究結直腸癌組織 ATF3基因表達的臨床意義分析時發現,ATF3基因表達與結直腸癌的發生密切相關,ATF3基因可能通過調控CyclinD1表達而促進結直腸癌的發生發展及侵襲轉移。但是ATF3基因在膀胱癌的作用可能會得出不一樣的結果。上海交通大學醫學院附屬新華醫院檢驗科沈立松教授領銜的科研團隊在膀胱癌侵襲轉移的機制研究中發現A TF3是一種新的膀胱癌轉移抑制基因,并闡明了A TF3通過調控凝溶膠蛋白(gelsolin)介導的細胞骨架蛋白重構抑制膀胱癌細胞轉移的新機制［19］。本研究也發現了NMIBC中ATF3基因表達上調,說明ATF3基因的重要作用。

結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)是轉化生長因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)的下游介質,具有明顯的有絲分裂原性和趨化性［20］。CTGF表達水平在纖維化組織中表達上調并且促進其發展,并且與傷口的愈合、腫瘤發生、進展、轉移及預后密切相關［21］。陳幕華等［22］通過研究甲狀腺組織CTGF基因的表達及其臨床意義發現CTGF在甲狀腺癌組織的高表達可能是腫瘤發生過程中的一個重要因素。但是該基因在膀胱癌中的作用尚未得到足夠的研究,其中對于NMIBC基因的上調,需要未來更多的研究去證實。金屬硫蛋白(MT)是一類普遍存在于各種生物的富含半胱氨酸的小分子蛋白,其主要功能是重金屬離子解毒,調控金屬離子代謝、抗氧化。大量的研究發現它還具有調節細胞繁殖周期的作用,與腫瘤的發生、轉移有關［23］。 Kim 等［24］研究表明,MT-2A 過表達可以增強乳腺癌細胞的轉移能力,其調控機制是通過激活AP-1和 NF-κB因子進而上調MMP-9蛋白實現的。MT-2A基因在膀胱癌中的作用尚未清晰,仍需更多的研究去支持。葡萄糖轉運蛋白3編碼基因 SLC2A3是SLC2A基因家族的一員,SLC2A3在多種類型癌癥細胞中均高表達,如間充質狀態的非小細胞肺癌和膠質細胞瘤、喉鱗狀癌、低分化的子宮內膜癌和乳腺癌中等［25］。高表達的SLC2A3與口腔癌的侵襲、大小、病理分期以及復發呈顯著正相關［26］。但SLC2A3基因在膀胱癌的相關研究尚需進一步驗證。

17β-羥甾類固醇脫氫酶(17-beta dehydrogenase1,HSD17B)屬于雌激素代謝酶,它參與調節組織中雄激素和雌激素水平。HSD17B2是NADPH依賴的氧化酶,它能催化高活性的17B-羥類固醇與低活性酮類固醇之間的轉換［27］。HSD17B2是雌二醇的失活轉變為雌激素酮的主要因素。HSD17B2同工酶可抑制肝臟、胎盤和子宮內膜中的性類固醇激素。有研究表明接近80%的膀胱尿路上皮癌患者的癌組織中,都可以檢測到表達雌激素受體,表達的升高與膀胱癌的不良預后緊密相關［28］。 吳育棟等［29］通過探究雌激素及其受體抑制BCG療效的機制與淺表性膀胱癌復發的關系發現雌二醇可以抑制BCG與腫瘤細胞的粘附及進入細胞從而降低BCG的療效。說明HSD17B2基因表達的下調可能是導致NMIBC預后較好的一個重要因素。脂肪酸結合蛋白(Fatty acidbinding proteins,FABPs)家族是一類參與脂類的運輸、代謝和細胞內信號傳導的細胞內蛋白質［30］。相關研究發現,FABP4可能參與了脂肪組織對多種腹腔腫瘤的轉移促進作用,包括乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、子宮內膜癌、黑色素瘤等,機制可能為其參與脂肪為腫瘤供能或對一些相關靶基因的表達調控［31］。Andersen等［32］發現FABP4基因的表達與膀胱癌的進展有關。本研究發現NMIBC基因下調,說明該基因對膀胱癌的侵襲性有一定的作用。

綜上所述,本研究利用GEO數據集,結合生物信息學分析方法,初步表明了ATF3基因、CTGF基因、MT2A基因以及SLC2A3在NMIBC樣本中的表達比在MIBC更高；可能是因為ATF3基因通過調控凝溶膠蛋白(Gelsolin)介導的細胞骨架蛋白重構抑制膀胱癌細胞轉移,這可能也是NMIBC患者預后明顯高于MIBC的原因。但是CTGF基因、MT2A基因以及SLC2A3基因在其他一些腫瘤中的表達往往與預后相關,與本研究得出的結果有差異,其中的原理尚需我們進一步驗證。HSD17B2基因和FABP4基因在MIBC樣本中的表達比在NMIBC中更高,HSD17B2基因的上調可以使雌激素受體激活,從而降低膀胱癌對于灌注化療的敏感性,這可能是影響其預后的重要因素。而FABP4基因的過度表達與腫瘤的侵襲性有重要關系,這也是其中的一個重要原因。本研究只是從生物信息學的角度進行分析,可能存在一定的偏差,其中的一些機制以及基因表達的研究需要更多的實驗繼續去驗證。