三陰性乳腺癌組織ICAM-1和Ki-67的表達及臨床意義研究

何 欣 ，劉鳳磊 ，王 濤 ，李曉琴 ，劉 瑋

（1.甘肅省腫瘤醫院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省人民醫院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省醫學科學研究院轉化醫學研究中心，甘肅 蘭州 730050）

乳腺癌是具有高度異質性的腫瘤，2013年ST.Gallen乳腺共識基于免疫組化染色對乳腺癌進行了分型，分為Luminal A-like型、Luminal B-like型、HER-2陽性型及三陰性型。三陰性乳腺癌（TNBC）即雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）及人表皮生長因子受體（HER-2）均為陰性表達[1-3]，因其基因表型的異質性，導致其組織學形態、治療反應和預后均同其他類型有明顯差異[4-6]。

細胞間黏附分子（Inter Cellular Adhesion Molecule-1，ICAM-1）又稱CD54，是免疫球蛋白超家族中一種重要的細胞黏附分子[7]，它的作用是介導細胞-細胞、細胞-細胞外基質間的相互結合，從而參與腫瘤細胞血管生成以及侵襲和轉移，與腫瘤細胞的生物學行為密切相關[8]。研究發現，ICAM-1在許多惡性腫瘤中高表達，且與腫瘤的發生、發展、浸潤和轉移密切相關[7-9]。

Ki-67是細胞增殖的相關抗原，在增殖細胞核中表達，主要用于判斷細胞的增殖活性，在所有活動的細胞周期（G1、S、G2和有絲分裂期）中表達，而在G0期不表達。Ki-67增殖指數高低與許多腫瘤的分化程度、浸潤轉移以及預后密切相關，也是惡性腫瘤預后的重要參考指標之一[10]。在三陰性乳腺癌中，Ki-67指數的預后價值并不十分明確。

本研究通過免疫組化回顧性檢測ICAM-1、Ki-67蛋白在72例三陰性乳腺癌組織及40例非三陰性乳腺癌組織中的表達，并持續跟蹤隨訪，探討其表達與臨床病理特征及預后的關系，以期為三陰性乳腺癌的個體化治療提供更多信息。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

（1）收集甘肅省腫瘤醫院2011—2013年收治的乳腺癌患者，經穿刺活檢或外科手術切除，病理結果確診為浸潤性乳腺癌標本。患者均為女性，其中三陰性乳腺癌標本72例，患者年齡30～77歲，中位年齡52歲；腫瘤大小：＜2 cm的29例，≥2 cm且≤5 cm的41例，＞5 cm的2例；浸潤性導管癌58例，浸潤性小葉癌1例，其他病理分型13例。非三陰性乳腺癌標本40例。所有標本經4%中性甲醛溶液固定后，常規石蠟包埋。

（2）所有三陰性乳腺癌患者均進行隨訪，隨訪時間22～74個月，中位隨訪時間62個月，其中死亡15例，5年生存率為79.17%。6例病人失訪或死于其他疾病。

1.2 方法

通過粗針穿刺的方式于化療前收集接受新輔助化療的乳腺癌患者的癌組織標本，對于未接受新輔助化療的乳腺癌患者，則是在根治手術后收集癌組織標本。三陰性乳腺癌組織病例是通過免疫組化染色選擇ER、PR、Her-2均為陰性以及免疫組化染色Her-2為1+或2+而FISH檢測無Her-2基因擴增的病例。

ICAM-1兔抗人單克隆抗體購自英國Abcam公司（貨號ab53013），Ki-67抗體購自福建邁新生物技術開發有限公司，應用免疫組化檢測ICAM-1蛋白的表達，具體操作按試劑盒說明進行。PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性標本作為陽性對照。

1.3 結果判讀

所有免疫組化片均由兩位副高以上病理醫師獨立雙盲觀察判讀，ICAM-1蛋白在細胞膜及細胞質中著色，判定標準采用陽性細胞比例和著色深淺相結合的方法，每張切片隨機選取5個視野，細胞數≤25%計1分，25%～50%計2分，＞50%計3分；顯微鏡下無著色計0分，著色為淺黃顆粒計1分，深黃或棕色顆粒計2分。最后兩者所得評分相乘，0分和1分為陰性表達，2、3、4和6分為陽性表達。Ki-67蛋白表達于細胞核，選取至少5個表達最高的代表性高倍視野（熱點區），根據陽性細胞所占比例計算陽性率。按照2013年St.Gallen會議共識，Ki-67陽性細胞＜14%定義為低表達，Ki-67≥14%定義為高表達[1，11]。

1.4 統計學分析

所有數據采用SPSS 16.0統計學軟件進行分析，兩獨立樣本組間比較采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法，并進行Log-rank檢驗。

2 結果

2.1 三陰性乳腺癌、非三陰性乳腺癌組織中ICAM-1的表達

ICAM-1表達于腫瘤細胞膜及細胞質中（見圖1），40例非三陰性乳腺癌組織中ICAM-1的陽性表達率為32.50%（13/40），72例三陰性乳腺癌組織ICAM-1的陽性表達率為68.06%（49/72），兩者比較，差異具有統計學意義（χ2=13.145，P＜0.05）。見表1。

圖1 免疫組化標記ICAM-1蛋白在TNBC中的表達情況

表1 ICAM-1在三陰性乳腺癌、非三陰性乳腺癌中的表達

2.2 Ki-67在三陰性乳腺癌組織和非三陰性乳腺癌組織中的表達

72例三陰性乳腺癌組織中，Ki-67的高表達率為88.89%（64/72）；40例非三陰性乳腺癌組織中，Ki-67的高表達率為70.00%（28/40）。三陰性乳腺癌組織中Ki-67高表達率明顯高于非三陰性乳腺癌組織（P＜0.05），見表 2。

2.3 ICAM-1蛋白的表達與三陰性乳腺癌臨床病理特征的關系

表2 三陰性乳腺癌和非三陰性乳腺癌組織中Ki-67的陽性表達

ICAM-1表達與患者年齡、腫瘤大小、脈管癌栓、神經侵犯無關（P＞0.05），但與組織學分級、淋巴結轉移、TNM分期、Ki-67高表達相關（P＜0.05），見表 3。

表3 ICAM-1在三陰性乳腺癌組織中的表達與臨床病理特征的關系（人）

2.4 Ki-67在三陰性乳腺癌組織中高表達與臨床病理特征的關系

Ki-67高表達率與患者年齡、脈管癌栓、神經侵犯、淋巴結轉移、TNM分期無關（P＞0.05），但與腫瘤大小、組織學分級相關（P＜0.05），見表 4。

2.5 ICAM-1蛋白的表達與三陰性乳腺癌5年生存率的關系

Kaplan-Meier生存分析顯示：49例三陰性乳腺癌ICAM-1蛋白陽性表達組患者的5年生存率為71.4%（35/49），23例三陰性乳腺癌ICAM-1蛋白陰性表達組的5年生存率為95.7%（22/23）；三陰性乳腺癌患者中，ICAM-1蛋白陽性表達組的5年生存率顯著低于ICAM-1蛋白陰性表達組（P=0.027）。見圖2。

2.6 Ki-67蛋白表達與三陰性乳腺癌5年生存率的關系

Kaplan-Meier生存分析顯示：三陰性乳腺癌患者中，Ki-67蛋白低表達組患者的5年生存率為100.0%（8/8），Ki-67蛋白高表達組患者的5年生存率為76.6%（49/64），Ki-67蛋白高表達患者的5年生存率下降明顯，但與Ki-67蛋白低表達組的5年生存率比較，差異無統計學意義（P=0.145）。見圖3。

3 討論

3.1 ICAM-1的功能及其與部分腫瘤發生發展的相關性研究

表4 Ki-67在三陰性乳腺癌組織中表達與臨床病理特征的關系（人）

圖2 ICAM-1蛋白低表達組與ICAM-1蛋白高表達組三陰性乳腺癌患者的5年生存率比較

圖3 Ki-67蛋白低表達組與Ki-67蛋白高表達組三陰性乳腺癌患者的5年生存率比較

乳腺癌是一類異質性明顯的惡性腫瘤，其發生、發展是個多基因、多步驟、多階段的過程。近年來，隨著現代醫學技術和分子生物學的發展，乳腺癌標志物的研究日益成為熱點。三陰性乳腺癌因對內分泌治療和Herceptin靶向治療效果欠佳、預后差、易復發及轉移等特點，對于其分子標志物的研究越來越受到研究者的關注。

細胞間黏附分子（ICAM-1）又稱 CD54，是免疫球蛋白超家族中重要的細胞黏附分子[7]。黏附分子分為五大類，包括鈣黏附素家族、整合素家族、選擇素家族、免疫球蛋白超家族和透明質酸黏素[12]，ICAM-1編碼人類的基因定位于第19號染色體上，包括6個內含子和7個外顯子[13]，該蛋白質的相對分子質量為80～110 KD，主要表達于血管內皮細胞和免疫細胞表面，與淋巴細胞功能相關抗原-1（LFA1）相結合，在正常組織結構的維持、炎癥與免疫應答、傷口修復、凝血與血栓形成以及腫瘤浸潤和轉移等多種生理、病理過程中均具有重要作用[14]。ICAM-1在人類正常乳腺、大腦、結腸、食管、腎、肝、卵巢、胰腺、前列腺、直腸、皮膚、小腸、宮頸組織表達缺失，但在正常脾臟、肺、淋巴結、胸腺、睪丸和骨組織中陽性表達[2]。ICAM-1在腫瘤學中的作用正在研究中，它在部分腫瘤中表達上調，與疾病進展、預后差、抵抗化療有關[2]。有研究發現，ICAM-1在許多惡性腫瘤中高表達，且與腫瘤的發生、發展、浸潤和轉移密切相關[7-9]。

3.2 ICAM-1與Ki-67蛋白在乳腺癌中的表達及其與三陰性乳腺癌臨床病理特征的關系

本研究應用免疫組化檢測ICAM-1蛋白在72例三陰性乳腺癌組織、40例非三陰性乳腺癌組織中的表達，結果發現，三陰性乳腺癌組織中ICAM-1陽性表達率明顯高于非三陰性乳腺癌組織（P＜0.05）。進一步對ICAM-1蛋白表達與臨床病理學參數的相關性分析顯示，ICAM-1表達與患者年齡、腫瘤大小、脈管癌栓、神經侵犯無關（P＞0.05），但與組織學分級、淋巴結轉移、TNM分期、Ki-67高表達相關（P＜0.05）。此外，本研究中Kaplan-Meier生存分析顯示：ICAM-1蛋白陽性表達組患者的5年生存率顯著低于ICAM-1蛋白陰性表達組（P＜0.05）。此結果提示，三陰性乳腺癌的惡性程度較高，臨床預后較差，且ICAM-1的表達與三陰性乳腺癌患者的惡性生物學行為及生存關系密切。

我們同時應用免疫組化檢測Ki-67蛋白在72例三陰性乳腺癌組織及40例非三陰性乳腺癌組織中的表達，結果發現，三陰性乳腺癌組織中Ki-67高表達率明顯高于非三陰性乳腺癌組織（P＜0.05），提示三陰性乳腺癌細胞增殖活躍。對Ki-67蛋白表達與臨床病理學參數的相關性分析顯示，Ki-67高表達率與腫瘤大小、組織學分級相關（P＜0.05），但與患者年齡、脈管癌栓、神經侵犯、淋巴結轉移、TNM 分期無關（P＞0.05）。Ki-67是細胞增殖的相關抗原，在增殖細胞核中表達，主要用于判斷細胞的增殖活性，說明癌細胞有絲分裂期越活躍，其體積越大、組織分級越高。Kaplan-Meier生存分析顯示：Ki-67蛋白低表達組患者的5年生存率為100.0%，Ki-67蛋白高表達組患者的5年生存率為76.6%，Ki-67蛋白高表達患者的5年生存率下降明顯，此結果對于判斷及預測三陰性乳腺癌患者預后有一定價值，但差異無統計學意義（P=0.145），可能是由于本次Ki-67蛋白低表達組患者樣本量較少（僅8例），有待進一步擴大樣本量進行研究。

3.3 ICAM-1、Ki-67蛋白在三陰性乳腺癌患者預后判斷及治療中的可能作用

通過本研究我們認為，ICAM-1、Ki-67蛋白在三陰性乳腺癌組織中呈高表達，且ICAM-1、Ki-67高表達與三陰性乳腺癌患者的惡性生物學行為及生存關系密切，提示ICAM-1、Ki-67蛋白有可能成為三陰性乳腺癌患者預后判斷的重要指標。同時，ICAM-1有望成為TNBC治療的新靶點，改變TNBC治療只能依靠單純性化療的現狀，并為其早期診斷及靶向治療提供一定的依據。