HBeAg對髓樣樹突狀細胞Toll樣受體4及NF-κB信號通路的影響

燕飛 湯永志 朱堅勝 朱敏 陳華忠 劉均艷

全球約20億人感染過HBV，約3.5億人是慢性HBV攜帶者，每年約有60萬人死于急、慢性HBV感染[1]。HBV感染后，機體通過細胞毒性T淋巴細胞反應殺死或抑制感染細胞內的病毒，控制HBV感染。目前認為，機體對HBV固有免疫和特異性免疫反應不足是導致病毒持續感染的主要原因[2]。有效的天然免疫反應和相對較強、持續、多特異性的T細胞介導的適應性免疫應答，在HBV感染機體后的免疫清除中起著重要作用[3]。樹突狀細胞（DC）是脊椎動物免疫系統的前哨，具有捕捉和表達抗原的特殊能力[4-5]。在機體清除HBV的免疫反應中，DC作為抗原提呈細胞而起著重要作用。目前研究發現，慢性乙肝患者體內DC成熟障礙和功能缺陷[6]。DC表面有廣泛的病原分子模式，能產生細胞內信號，以激活宿主反應來識別病原，其中Toll樣受體（TLR）最具特征性。TLR是一類跨膜模式識別受體，廣泛表達于特異性免疫細胞和非特異性免疫細胞，它在促進先天免疫反應中起著重要作用[7]。相關研究表明，TLR4在肝病進展中起著重要作用[8-9]。本研究通過體外培養將單核細胞誘導為髓樣DC（mDC），并探討HBeAg對mDC TLR-4及NF-κB信號通路的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 重組人粒細胞巨嗜細胞集落刺激因子（rh GM-CSF）、rh IL-4購自美國 R&D 公司；HBeAg購自以色列Prospec公司；抗人FITC-人類白細胞抗原-DR、抗人CD11c-PE、同亞型對照抗體購自美國Ebioscience公司；細胞增殖檢測（MTS）試劑購自美國Promega公司；脂多糖（LPS）購自美國Sigma-aldrich公司；RIPA-1640培養基購自美國Hyclone公司；FBS購自美國Gibco公司。

1.2 mDC體外誘導分化 采集并分離健康志愿者外周血，經淋巴細胞分離液梯度離心法獲得單核細胞；用無血清RIPA-1640培養基懸浮細胞，在37℃、5%CO2孵箱培養2h，PBS洗去非貼壁細胞，獲得貼壁的單核細胞；加入含 20%FBS的 RIPA-1640培養基，rh GM-CSF 750IU/ml、rh IL-4 870IU/ml誘導培養，隔日半量換液并補充rh GM-CSF、rh IL-4，第7天收集懸浮細胞。

1.3 細胞形態及表型鑒定 收集培養7d的mDC，在掃描電鏡下觀察細胞形態；使用抗人FITC-人類白細胞抗原-DR、抗人CD11c-PE標記，采用流式細胞術鑒定細胞表型。

1.4 HBeAg刺激mDC 在培養7d的mDC中加入HBeAg 5μg/ml或不加 HBeAg（對照組），培養 24h；每孔加入LPS 1μg/ml培養，第9天收集懸浮細胞。

1.5 HBeAg對TLR4、NF-κB信號通路蛋白表達的影響采用Western blot法檢測。收集上述各組培養9d的mDC，提取蛋白；將各組蛋白等量上樣，經過電泳、轉膜、封閉，分別加入 TLR4、NF-κB 一抗，4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2h，增強化學發光法顯色。采用紫外投射凝膠成像系統掃描后，應用Quantlty one軟件進行灰度值分析。計算樣本目的蛋白灰度值/內參基因條帶灰度值的比值，即蛋白相對表達量。

1.6 HBeAg對mDC刺激同種異體淋巴細胞增殖能力的影響 采用MTS法。同樣密度梯度離心法分離另一正常人外周血單核細胞，經貼壁2h后收集非貼壁細胞，用含20%FBS的RIPA-1640培養基重新懸浮作為淋巴細胞；收集第9天各組mDC，經絲裂霉素C處理后作為刺激細胞。mDC 與淋巴細胞按 1∶5、1∶10、1∶20 的比例加入96孔板，共培養4d。培養結束前4h，每孔加入MTS試劑孵育 4h，檢測其吸光度（A）。刺激指數=（A實驗組-本底）（/A對照組-本底）。

1.7 統計學處理 應用SPSS 18.0統計軟件。計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 mDC體外培養形態及表型鑒定 外周血單核細胞加入rh GM-CSF、rh IL-4培養7d，光鏡下可見懸浮細胞胞體增大，細胞表面可見較多樹杈樣突起，見圖1ab；電鏡下可見細胞表面粗糙，邊緣短小毛刺樣突起，為典型mDC形態特征，見圖1c。rh GM-CSF+rh IL-4誘導培養7d的懸浮細胞中，CD11c/HLA-DR雙陽性細胞比例為（86.2±1.85）%，明顯高于單純培養組的（9.01±1.12）%，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 2。

圖1 mDC體外培養7d光鏡及電鏡下所見（a：光鏡下，×100；b：光鏡下，×400；c：電鏡下，×6 510）

圖2 rh GM-CSF+rh IL-4誘導組與單純培養組雙陽性細胞比例的比較

2.2 HBeAg對TLR4、NF-κB信號通路蛋白表達的影響 培養至第9天，HBeAg刺激組TLR4、NF-κB相對表達量為 0.12±0.01、0.75±0.12，分別低于對照組的0.27±0.03、1.20±0.13，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；提示HBeAg抑制mDC TLR4信號通路蛋白表達，見圖3。2.3 HBeAg對mDC刺激同種異體淋巴細胞增殖能力的影響 在 DC/淋巴細胞比例為 1∶5、1∶10、1∶20 的反應中，HBeAg 刺激組刺激指數為 2.93±0.05、2.56±0.19、1.44±0.09，分別低于對照組的 4.83±0.05、3.57±0.35、2.13±0.11，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；提示HBeAg減弱mDC刺激同種異體淋巴細胞增殖能力。

圖3 培養至第9天HBeAg對通路蛋白表達的影響（a：NF-κB；b：TLR4）

3 討論

HBV持續感染是導致肝硬化、肝功能衰竭和肝細胞癌的主要原因。研究發現，慢性乙肝患者針對HBV的特異性免疫應答減弱，CD8+細胞增殖能力及功能均下降[10]。在慢性乙肝患者體內激活HBV特異性免疫應答，可以有效控制病毒復制并減輕肝臟損傷[6]。現在普遍認為，免疫耐受可能是導致慢性HBV感染的一個關鍵因素，但是具體機制仍不清楚。

近年來，DC在慢性HBV感染免疫學發病機制中的作用受到重視。mDC是一種功能強大的抗原提呈細胞，在調節T細胞功能方面具有重要作用。受微生物抗原刺激后，mDC可分泌大量IL-12、IFN-γ，從而誘導Th1分化。最近研究表明，慢性HBV感染患者DC功能明顯受損[6,11]。Vander等[12]研究發現，在慢性乙肝患者體內mDC數量減少。相關研究發現，與HBsAg攜帶者比較，免疫耐受患者DC表面 CD80、CD86及 HLA-DR表達下降，刺激淋巴細胞增殖能力下降，IL-12分泌減少，與HBVDNA呈負相關；同時，DC功能對HBeAg血清學轉換具有重要作用[13]。研究發現，健康者外周血來源的mDC與HBsAg共培養后，可刺激T細胞能力增強，IL-12分泌增多[14]，DC對HBV復制的抑制作用增強[6]。可見，DC在慢性HBV感染的發病機制中具有重要作用。

HBV的一種或多種抗原可能利用多種途徑抑制針對HBV的免疫應答，從而導致針對HBV的免疫耐受。HBeAg對HBV感染和復制并不是必需的；但有研究表明HBeAg對慢性HBV感染是必需的，且可能在慢性乙肝患者免疫應答中起著免疫調節作用[10,15]。Purvina等[16]研究證實HBeAg通過IL-1信號抑制T淋巴細胞增殖，反過來又促進慢性感染的發生。另一研究結果發現，HBeAg可通過下調IL-18介導的IFN-γ表達來調節免疫應答[17]。Chen等[10]研究結果顯示，HBeAg可以抑制淋巴細胞的增殖，減少IFN-γ的產生，這可能是HBV免疫耐受的分子機制之一。健康者單核細胞來源的mDC經HBeAg刺激后，淋巴細胞增殖能力明顯減弱，即HBeAg刺激后的mDC免疫應答反應明顯減弱，但通過什么信號途徑調節DC功能尚不清楚。TLR4通過病原體相關分子模式識別病原體，從而激活下游NF-κB、MAPK信號轉導途徑，引起下游細胞因子分泌增加，發揮重要的免疫作用。研究發現TLR4的激活可抑制HBV感染，且TLR4的抗病毒作用通過NF-κB途徑進行[18]。然而，HBeAg抑制了TLR介導的炎癥轉錄因子、NF-κB和IFN-β的激活[19]，可能是慢性HBV感染的原因之一。但是，關于HBeAg能否通過TLR4信號通路影響DC功能，目前仍不清楚。本研究結果發現，HBeAg刺激mDC后，TLR4、NF-κB蛋白相對表達量明顯下降；TLR4及下游NF-κB蛋白被抑制后，mDC刺激T淋巴細胞增殖能力明顯減弱。可見，HBeAg通過TLR4及NF-κB信號通路抑制DC的特異性免疫反應。

綜上所述，HBeAg刺激mDC后，可抑制TLR4及NF-κB信號通路，減弱DC的免疫功能，可能是HBV免疫耐受的機制之一，這為認識持續HBV感染的形成原因提供了新信息。由于TLR4下游有NF-κB和MAPK通路，因此進一步研究HBeAg是否通過影響MAPK信號通路來抑制DC免疫功能，有助于從分子機制方面闡明持續HBV感染的原因。