小劑量二乙基亞硝胺誘導大鼠肝纖維化模型的建立

玉蘇甫·吐爾遜，趙燕霞

在人體研究肝纖維化過程往往受到多種限制，所以實驗性動物模型的應用成了研究者的必然選擇[1～5]。本研究采用二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）誘發大鼠肝纖維化模型，以期為預防和防治肝纖維化的發生和發展提供一種理想的動物模型。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試劑 SPF級雄性Wistar大鼠30只，體質量（160±20）g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供[許可證號：SCXK（新）2003-001]。S22PS分光光度計（上海棱光技術有限公司），TGL-16G高速常壓離心機、TDL-5A低速離心機（上海安亭科學儀器廠），K-S2.4型電熱恒溫水浴鍋（金壇市醫療儀器廠），RM-2135型石蠟切片機（德國 Leica公司），EG-1150C型組織包埋機（德國 Leica公司），CH型OLYMPUS光學顯微鏡（Olympus公司），Image Pro Plus 5.1圖像分析系統（Olympus公司）。檢測SOD、GSH-PX、MDA 試劑盒（南京建成生物工程研究所），戊巴比妥鈉和DEN（Sigma公司）。

1.2 血清ALT和AST含量測定 使用全自動生化分析儀測定。

1.3 血清SOD、GSH和MDA測定 按南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明由專人檢測。

1.4 肝纖維化模型的建立 將30只動物隨機分為正常組和模型組，每組15只。給予模型組動物0.1 mg/mL低濃度DEN溶液（用滅菌蒸餾水配制）腹腔注射，1次/d，連續11 w；給予正常組大鼠滅菌生理鹽水注射，連續11 w。在11 w末實驗結束時，給予大鼠1%戊巴比妥鈉0.3ml/100 mg腹腔注射麻醉，剖開腹部，分離腹主動脈取血，-80℃保存待檢。處死大鼠后，從肝左葉切取一塊大小 1.0 cm×0.8 cm×0.3 cm組織塊，迅速置于10%甲醛溶液中固定，5 d后取材、石蠟包埋、切片、HE染色，光學顯微鏡下觀察。取體積小于1 mm3的肝組織塊，用4%戊二醛和1%鋨酸雙固定，丙酮梯度脫水，Epon812環氧樹脂包埋，在電鏡下觀察。

1.5 統計學分析 應用 Excel整理數據，應用SPSS 17.0 軟件進行數據分析，計量資料以（±s）表示，行方差齊性檢驗和單因素方差分析，采用LSD法進行組間兩兩比較，檢驗水準為α＝0.05，即P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清指標變化的比較 在實驗結束時，模型組動物血清ALT和AST水平明顯高于對照組（P＜0.001），血清SOD和GSH水平較對照組減低，而MDA水平顯著升高，均有顯著性差異（P＜0.01，表1）。

2.2 肝組織病理學變化 模型組動物肝組織出現肝細胞變性、細胞增生、壞死和假小葉形成（圖1和圖2），正常組肝臟細胞正常，未見水腫、腫脹、壞死（圖3和圖4）。

2.3 肝組織超微結構的變化 模型組主要以肝細胞核內異染色質增加、細胞器數量減少、基質密度降低和肝糖元減少表現為主（圖5和圖6）；正常組肝細胞內線粒體、內質網結構正常，細胞器分布均勻，肝糖原數量基本正常（圖7和圖8）。

表1 兩組血清指標（±s）比較

表1 兩組血清指標（±s）比較

與正常組比，①P＜0.001；②P＜0.01

只 ALT（U/L） AST（U/L） SOD（U/mg Prot） GSH（U/mg Prot） MDA（nmol/mg prot）正常組 15 56.51±11.2 63.26±10.0 178.57±22.8 45.16±2.9 3.76±0.7模型組 15 410.08±93.6① 399.7±90.9① 83.08±22.0② 24.65±2.0② 9.78±2.0②

圖1 模型大鼠肝組織學表現（HE，100×） 肝細胞壞死明顯，假小葉形成且界限清晰，見明顯的纖維組織增生

圖2 模型大鼠肝組織學表現（HE，100×） 正常肝小葉結構消失，可見大小不一的肝細胞團和假小葉結構形成，有不同程度的纖維組織增生，細胞間隙增寬，還可見到炎細胞浸潤，部分肝細胞進一步水腫、變性、壞死，部分小膽管內見膽汁淤積

圖3 正常大鼠肝組織學表現（HE，100×） 肝小葉結構完整清晰，肝細胞索排列整齊，圍繞小葉中央靜脈呈放射狀排列，細胞大小一致，肝血竇無狹窄，肝小葉及匯管區無炎性細胞浸潤，未見水腫或腫脹的肝細胞，未見壞死的肝細胞，無明顯纖維組織增生或纖維化

圖4 正常大鼠肝組織學表現（HE，100×）

圖5 肝組織超微結構變化（9400×）模型組膽管上皮輕微水腫，肝細胞中度水腫，基質密度降低，肝糖元減少，異染色質輕微邊集，細胞內可見線粒體和內質網結構基本完整，肝血竇內壁水腫，肝血竇面微絨毛減少，肝細胞間隙增寬

圖6 肝組織超微結構變化（9400×）模型組肝細胞內可見線粒體增多，內質網結構基本完整，異染色質邊集。肝血竇面微絨毛明顯減少，肝細胞水腫明顯，基質密度明顯降低。肝糖元明顯減少，毛細膽管明顯擴張，肝血竇內壁水腫，膽管上皮水腫。肝細胞內可見密度較深的顆粒

圖7 肝組織超微結構變化（9400×） 正常肝細胞線粒體和內質網結構正常，細胞器分布均勻，毛細血管輕微擴張，肝血竇內皮細胞未見腫脹，肝細胞矢狀面微絨毛未見異常

圖8 肝組織超微結構變化（9400×）

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝病發展為肝硬化的中間環節。肝纖維化的發病機制尚未完全清楚，但肝星狀細胞激活并轉化為肌成纖維細胞和成纖維細胞，是肝纖維化發生發展的核心環節[6]。肝損傷是引發肝纖維化的始動環節。肝細胞和其他肝非實質細胞旁分泌釋放一些細胞因子激活肝星狀細胞，活化的肝星狀細胞增生，合成細胞外基質，同時表達部分細胞因子自分泌，共同參與調控過程。其結果，肝細胞外基質過度彌漫性沉積，形成肝纖維化肝硬化化[7]。國內外學者對肝纖維化的發病機制，診斷和防治方法進行了不懈的探索。已有資料證明，肝臟慢性損傷過程中細胞外基質累積所形成的肝纖維化，甚至肝硬化是可逆的。但是迄今抗肝纖維化的臨床治療尚無突破，更引起人們對肝纖維化研究的重視化[8]。

眾所周知，DEN作為大鼠肝纖維化模型的誘導劑是研究應用最為廣泛的化學制劑。研究表明，它是一種具有肝毒性、細胞毒性和免疫毒性藥物，且對肝臟有明顯的親和性，使肝臟發生中毒性改變[14，15]。血清AST和ALT含量變化對肝功能損害程度有一定的參考價值。本實驗研究提示模型組血清ALT和AST含量較對照組成倍的升高，考慮模型組肝功能不同程度的損害，與文獻報道一致[16，17]。DEN是一種選擇性的肝臟毒性物質，通過氧化細胞蛋白質DNA以及生物膜脂質，導致肝細胞壞死，形成脂質過氧化終產物MDA，故測定肝組織中MDA可以間接反映肝細胞的損傷程度[18]。SOD是體內重要的抗氧化酶，能消除生物體在新陳代謝過程中產生的有害物質。本實驗結果提示，與正常組比較，模型組MDA含量明顯升高，SOD含量明顯下降，其發生機制可能是SOD與MDA之間的平衡被打破，組織不能抗氧化清除自由基，造成肝纖維化的形成。

GSH是機體內廣泛存在的一種含硒抗氧化酶，可通過特異性催化GSH對氫化氧化物的還原反應，而消除細胞內有害的過氧化代謝產物，以阻斷脂質過氧化連鎖反應，從而對保護細胞代謝的正常進行起到重要作用。隨著機體內能導致肝纖維化的自由基水平的不斷增多，GSH-Px活性降低，因此可以作為評價肝纖維化的又一個重要指標[19]。肝臟病理學檢查結果主要是發現出現不同程度的肝組織內纖維組織增生加重，正常肝小葉結構消失和形成典型的假小葉結構。目前，很多學者認為肝臟假小葉形成，即為肝硬化形成[20，21]。肝臟超微結構方面的改變主要以肝細胞核內異染色質增加、細胞器數量減少、基質密度降低和肝糖元減少等變化，提示肝細胞有進一步的損傷，誘導肝纖維化的形成，與文獻[22～24]報道吻合。

本實驗表明，低濃度DEN溶液可以建立穩定的肝纖維化大鼠模型，其過程相似于人類纖維化的發生過程，且其肝纖維化形成率高，動物死亡率低，實驗重復性好，便于進行藥物干預和療效分析。因此，該模型是較為理想的肝纖維化研究模型。