不同HBV感染轉歸人群外周血PD-1拷貝數分布研究*

李 芳，鄒桂舟，葉 珺，郜玉峰

宿主遺傳變異的多樣性涉及基因單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）和拷貝數變異（copy number variations，CNVs）等[1～3]。CNVs是指在個體基因組中，一段DNA片段的拷貝數在亞微觀范疇內發生了變異，導致相對于參考基因組有著不同的拷貝數，這里的DNA片段均大于1kb，這些突變可能是刪除或復制或插入的結果，它們通常覆蓋了大約15%人類基因組。除了影響DNA序列的拷貝數（copy number，CN）外，CNVs還可以通過數量或位置的改變影響基因表達，并進一步影響到個體疾病的易感性和疾病進展[4-6]。程序性死亡受體-1（programmed cell death-l，PD-1）分子是近年來新發現的一個具有負性調節作用的共刺激信號分子，是一種I型跨膜糖蛋白，屬于B7/CD28家族中的一員，含有N-端和C-端兩個酪氨酸殘基[7～10]。活化的B 細胞、自然殺傷細胞（nature killer cell，NK）細胞和CD4+T細胞等表面可表達PD-1。既往有研究表明PD-1/PD-L1介導的信號通路對于HBV感染慢性化及疾病轉歸有重要的作用[11]。PD-1一共有50多個SNP基因位點，其中多個基因位點多態性與HBV感染后不同轉歸密切相關[12]。本研究采用Accu Copy檢測技術分析了HBV感染不同臨床型人群外周血PD-1基因拷貝數分布頻率的差異，以了解機體免疫遺傳學背景對HBV感染轉歸的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2014年6月～2017年6月我院診治的漢族HBV感染者1109例，其中809例為血清HBsAg陽性超過6個月的慢性感染者，另300例為既往有急性或CHB病史，但血清HBsAg陰性，HBsAb陽性或陰性，HBcAb陽性，HBV DNA低于最低檢測限，血清ALT水平正常，被定義為HBV感染恢復。在809例慢性HBV感染者中，437例為CHB患者，249例為LC患者，123例為HCC患者。排除藥物、自身免疫、酒精、合并其他嗜肝病毒感染造成的肝損傷，排除妊娠婦女。所有研究對象簽署知情同意書，本課題已通過我院醫學倫理委員會審批。

1.2 外周血PD-1基因拷貝數檢測 采集受試者外周血2 ml，置于EDTA-K2管，使用QIAGEN基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，純化，置于-20℃凍存。采用多重AccuCopy技術檢測PD-1基因2個目的DNA片段CNVs。采用文獻報道[13]的方法，合成PD-1特異性引物和競爭模板（表1）。根據Genesky生物技術要求，設計并合成了12個目標段的競爭DNA，進行多重PCR擴增，將PCR產物稀釋20倍后，上樣至ABI3 730XL測序儀（Applied Biosysterns公司，美國），經PCR擴增，采用毛細管電泳法分離DNA片段，采用GeneMapper4.0軟件分析。通過目的基因與內參基因S/C值比較，進行均一化處理，得到絕對定量的PD-1基因拷貝數。

1.3 統計分析 應用SPSS 16.0軟件分析，采用卡方檢驗比較各組之間PD-1拷貝數分布頻率；選擇5個可能影響慢性HBV感染結局的指標（HBeAg滴度、年齡、性別、病毒載量、PD-1拷貝數），行Logistic回歸分析，運用邏輯回歸模型分析變量與疾病結局的關系，P＜0.05提示具有統計學差異。

表1 PD-1特異性引物和競爭模板

2 結果

2.1 各組人群基線資料 見表2。

表2 各組人群基線資料（n，±s）

表2 各組人群基線資料（n，±s）

例數 男性/女性 年齡（歲） 95%CI感染恢復 300 165/135 45.26±15.54 43.94～47.03 CHB 437 350/87 34.09±12.70 32.89～35.28 LC 249 196/53 50.27±13.31 48.62～51.93 HCC 123 101/22 53.75±12.53 51.49～55.98

2.2 各組PD-1基因拷貝數分布頻率比較 將2個拷貝和3個拷貝合并為多倍體，1拷貝被認為是單倍體。與HBV感染恢復組比，LC組多倍體顯著升高（x2=4.473，P=0.034）；CHB、LC 和 HCC 患者外周血PD-1基因拷貝數分布差異無統計學意義（x2=3.256，P=0.196，表3）。

表3 各組PD-1基因拷貝數分布頻率（%）比較

2.3 影響HBV感染結局的因素分析 將年齡、性別、PD-1的CN、HBV DNA和HBeAg滴度賦值，建立多元回歸方程，以CHB作為估計參數，結果影響疾病預后的因素是年齡（x2=126.717，P=0.000）和 HBV DNA（x2=44.155，P=0.000，表4）。其中年齡≥40歲是由CHB進展至LC或HCC的危險因素，而HBeAg陰性患者更有可能由CHB進展至HCC。

表4 多元Logistic回歸分析

3 討論

近些年來的研究發現，PD-1是一種負性調節作用的共刺激信號分子，它以單體的形式表達于CD4+和CD8+T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、骨髓細胞和樹突狀細胞等細胞表面[14，15]。通常，PD-1與其兩個配體PD-L1和PD-L2共同組成信號通路以發揮負性調節作用。研究表明，在慢性HBV感染患者肝組織肝細胞表面可以出現PD-L1的過度表達，通過PD-1/PD-L1的信號通路進一步導致CD8+T細胞的功能受到抑制，從而發生T細胞功能的耗竭，淋巴細胞分泌的一些抗病毒細胞因子如IFN-γ和TNF-α的表達減少，從而導致了病毒感染呈現持續存在的狀態[16]。同時，PD-1的上調則有利于Th2細胞因子產生IL-10，而降低Th1細胞分泌IFN-γ，從而也可導致病毒感染的慢性化[17]。除此之外，不同宿主之間的免疫反應程度存在不同，因此研究者們認為HBV感染的結果受到病毒和宿主遺傳多樣性的影響，其中包括SNP和基因的CNVs。本研究通過對HBV感染不同臨床型人群外周血PD-1的CNVs的檢測和統計分析，發現HBV感染恢復人群與LC組之間在PD-1基因拷貝數分布頻率上存在著差異，即與HBV感染恢復者比，LC組PD-1多倍體所占比例更高，而其他各組間PD-1拷貝數差異無統計學意義。研究發現，17.7%基因多態性與拷貝數變異有直接相關性，并且這些拷貝數變異大部分與基因的表達呈正相關關系，其中僅僅大約有15%表現出負相關關系[18]。針對PD-1基因拷貝數與HBV mRNA水平進行的比較分析發現兩者基因表達水平之間并不是簡單的正相關或負相關關系，而是存在著十分復雜的調控關系[19]。根據上述理論，結合本研究結果提示慢性HBV感染可能與PD-1的高表達有關，發生這種改變考慮與機體的自我保護性調節作用有關。一方面機體長期受HBV感染，導致病毒特異性T淋巴細胞PD-1表達增加，從而產生一種保護性的調節作用，導致機體免疫應答下調，避免持續活化的免疫應答導致機體組織產生免疫病理性損傷，但同時另一方面，PD-1信號通路的持續活化又抑制了CD8+T淋巴細胞功能，使其發生功能衰竭，從而使乙型肝炎病毒難以完全清除，導致了感染的持續化[20]。這種調節機制與本研究結果相符合，經過統計學分析發現PD-l基因拷貝數高的人群主要集中在肝硬化組，因此我們認為很有必要對PD-1基因呈多拷貝數的慢性HBV感染者進行長期的追蹤及隨訪，以及時觀察疾病的進展，防止其進展至終末期肝病階段。同時，我們希望可以通過阻斷PD-l/PD-L1這條信號通路來提高機體特異性T淋巴細胞的功能，從而有利于清除的病毒，這也為進一步進行慢性HBV感染的防治研究開辟了新的方向。雖然我們研究發現HBV感染恢復者與LC組外周血PD-1基因分布頻率存在拷貝數差異，但將慢性HBV感染組再根據疾病進展分為CHB、LC和HCC三組，并進行統計學分析后發現這三組之間PD-1基因拷貝數分布頻率無明顯差異，我們綜合分析其原因可能有以下幾種：1，CNVs并不是控制HBV感染預后的唯一遺傳易感因素，CNVs與基因表達之間存在著十分復雜的調控關系。在未來進行研究時可將多種遺傳易感因素聯合起來進行關聯研究；2，影響慢性乙型肝炎感染后轉歸的因素除了考慮其HBV DNA水平外，同時還要考慮HBV RNA及其蛋白水平，因此將三者聯合起來進行研究可更明確基因的調節是如何進一步影響疾病轉歸的；3，本研究為單中心選擇樣本，影響結果的因素較多，比如診斷的標準化、人口學配比、診斷和檢測試劑的統一、不同臨床疾病診斷的統一及其臨床分度或分期、并發癥或合并癥、受教育程度、經濟狀況、治療藥物選擇、不同治療方法等等，都可能會出現選擇偏倚或影響結果分析。所以，在今后的研究中需要進一步擴大樣本量，從而可以更有效地統計分析研究結果。

既往研究發現PD-1表達水平與肝臟發生炎癥損傷的程度存在相關。所以，我們認為宿主PD-1基因多態性在不同HBV感染轉歸人群是不同的，從而可以在某種程度上影響個體的疾病表現形式，值得我們展開進一步研究。在今后的研究中，不僅需要觀察外周血T淋巴細胞PD-1 mRNA水平，更需要進一步研究在肝組織內T淋巴細胞PD-1表達情況以及PD-1表達與肝組織炎癥程度的相關性，并且進一步準確地分析PD-1 CNVs對于PD-1基因表達的影響，從而進一步開展基因拷貝數的功能性研究，以闡明PD-1在乙型肝炎病毒感染過程中的具體作用機制，為慢性乙型肝炎的防治提供一個新的思路和研究方向。