慢性乙型肝炎患者HBV基因型分布及其耐藥基因突變分析*

張歡歡 ，楊 歡，沈思蘭，陳佳婕，宣彬彬

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染仍是一個世界性的公共衛生問題。全球慢性HBV感染人數約有4.3億，其中會演變成肝硬化和肝癌者為12%～35%[1]。如今，能夠抑制HBV感染患者病情發展的主要方法是應用核苷（酸）類似物【nucleos（t）ide analogues，NAs】和 α- 干擾素治療[2]。拉米夫定（LAM）、阿德福韋（adefovir，ADV）、替比夫定（telbivudine，LdT）、恩替卡韋（entecavir，ETV）和替諾福韋（tenofovir disoproxil fumarate，TDF）先后上市被應用于臨床[3-7]。長期使用NAs會造成HBV變異，造成病毒耐藥。如何及時發現潛在的病毒耐藥特性而合理地應用NAs治療有非常重要的臨床意義。本文主要探討了慢性乙型肝炎（CHB）患者HBV基因型分布及其病毒耐藥突變情況，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年8月～2017年8月我院診治的CHB患者240例，男166例，女74例；年齡為21～65歲，平均年齡為（42.7±12.5）歲。診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》的標準[8]。

1.2 抗病毒治療方案 本組240例CHB患者接受了NAs治療，為單藥治療、聯合治療和序貫治療。聯合治療指兩種不同作用機制或互補作用機制的NAs聯合使用；序貫治療或稱為轉換治療，即當初始治療藥物出現療效差或耐藥突變時，換用另一種NAs治療。各種藥物治療均超過3個月。

1.3 檢測方法 患者知情同意，采集靜脈血。使用日本Wako公司生產的生化分析儀檢測血生化指標；采用羅氏電化學發光儀及其試劑檢測血清HBV標志物；使用羅氏Cobas-Taqman 48全自動核酸提取檢測系統和實時熒光定量PCR法檢測血清HBV DNA（檢出下限為 20 IU/ml）；HBV 逆轉錄（RT）區的PCR擴增以及序列測定：采用巢式PCR法擴增RT 區，引物為 RTl：5，-AGTCAGGAAGACAGCCTAC TCC-3，RT2：5，-AGGTGAAGCGAAGTGCACAC-3。進行第一輪PCR反應，擴增條件：94℃2 min；94℃45 s，59℃ 1 min，72℃ 70 s，共 35 個循環。引物RT3：5，-TTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTC-3，和RT4：5，-TTCCGCAGTATGGATCGGCAG-3。進行第二輪 PCR 擴增，PCR 條件：94℃35 s，56℃ 1 min，72℃ 50 s，共35個循環。將PCR產物純化后，由廣州華大基因公司完成測序；HBV基因型測定：將HBV S基因序列分別與HBV A～H各基因型的標準序列進行比對，差異性＜4%者，歸為同一基因型；耐藥位點分析：應用Blast生物信息學軟件對測序結果進行分析。

1.4 統計學分析 應用SPSS 20.0統計學軟件，計數資料的比較采用x2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CHB患者血清ALT和HBV載量情況 240例CHB患者血清ALT水平為（80.3±24.6）U/L，血清HBV DNA 水平為（3.2±1.4）lg IU/ml。

2.2 不同NAs抗病毒治療患者耐藥突變發生率比較 聯合或序貫治療患者耐藥突變位點為rtA194T，其耐藥突變發生率顯著高于恩替卡韋治療患者（P＜0.05，表1）。

表1 不同藥物治療患者耐藥突變率（%）比較

2.3 HBV基因型和耐藥突變情況 在240例CHB患者中，B型21例（8.8%）、C型 216例（90.0）、D型3例（1.2%）。在發生耐藥突變的91例患者中，B型6例（6.6%）、C型83例（91.2%）、D 型 2例（2.2%）。三種HBV基因型感染患者耐藥突變率差異無統計學意義（x2=1.22，P＞0.05）。在發生耐藥突變的6例B型患者中，有2例（33.3%）發生了多重耐藥突變；在發生耐藥突變的83例C型患者中，有15例（18.1%）發生了多重耐藥突變；D型感染者未發生多重耐藥突變病例。

3 討論

急性乙型肝炎患者康復之后體內仍會存在強烈的針對HBV的特異性應答，盡管如此，由于體內存在的失去轉錄活性的共價閉合環狀HBV DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），而使病毒處于潛伏狀態，可能在應激狀態下非常容易再次激活HBV感染。治愈CHB患者，理論上要包括兩個層面，既要消除肝細胞表面的HBsAg，又要消除肝細胞核內的cccDNA[9]。但是，到目前為止，還沒有能夠直接將cccDNA清除的抗HBV藥物，也還沒有被公認為能夠穩定檢測cccDNA的方法[10]。所以，比較現實的目標是先實現“免疫學治愈”，類似于急性肝炎患者緩解后的免疫功能狀態，也就是通過治療后持續性的病毒學應答將病毒水平壓得很低，讓肝損傷保持持續的緩解狀態，降低肝細胞癌化的風險，這種療效也叫做“臨床治愈”和“功能性治愈”[11]。

功能性治愈的核心是消滅HBsAg甚至是使其發生血清轉換，表明在停藥之后疾病緩解是持續性的。乙型肝炎病毒感染是導致肝硬化和肝細胞癌的重要原因。32%HBV感染者會發生肝損傷而導致CHB，全球由CHB發展為肝細胞癌者占到85%，清除HBsAg會降低肝細胞癌發生的風險，血清HBV DNA轉陰患者發生肝細胞癌的風險大約降低4倍[12]。研究發現，血清HBeAg陰性患者在HBV DNA水平從2000 IU/ml降到1000 IU/ml時，會明顯降低癌變的風險[13]。反之，當血清HBV DNA上升超過1000IU/ml時，一般預示著可能會出現肝炎以及疾病的進展。如果在接受治療之后患者血清HBsAg水平不超過100 IU/ml，通常情況下可以看作為不會導致疾病的復發。另外，血清HBsAg水平也會影響體內共價閉合環狀DNA載量[14]。血清HBsAg水平可以作為宿主抵抗乙型肝炎病毒感染能力的評估指標，可能具有潛在的評估CHB患者遠期預后的能力。所以，當前治療CHB患者獲得理想效果是血清HBsAg轉陰或者是伴HBsAg血清轉換[15]。

早期全球的多項臨床試驗發現Peg IFN-α聯合LAM連續治療CHB患者46～50周，能很快抑制病毒復制，并且具有更低的耐藥風險，但是其缺點在于停止給藥之后22～24周發現與不聯合LAM的單獨藥治療者，血清HBsAg陰轉和血清轉換效果更差些[16]。在另外的前瞻性開放性試驗中使用ADV聯合Peg IFN-α治療46周，對患者進行跟蹤觀察發現2年后CHB患者血清HBsAg陰轉率為15%，該研究沒有設置單獨給藥組，所以沒有證據能夠證明聯合使用的效果更好[17]。隨著治療技術的不斷發展，結合使用耐藥屏障更高的NAs與IFN-α聯合，能否獲得更好的協同作用受到越來越多的關注。當前，有報道關于聯合TDF或單獨使用IFN-α的對比治療發現，聯合治療70周要比單獨治療46周患者在血清HBsAg陰轉率方面高出4倍，而單獨使用TDF者無陰轉。研究發現在參與聯合治療的患者，大部分獲得應答者都是A基因型感染者，其他型感染者則少有應答。所以，這種治療是否適合亞裔人群，還需要不斷的探索和評價[18]。

臨床上，比較常見的耐藥是應用LAM治療，因為該藥開始使用的時間比較早，連續4年單獨使用該藥物進行治療會有接近55%～65%患者發生耐藥，LAM和Ldt耐藥是交叉的，還會促進ETV和ADV使用者的耐藥。當前，ETV初始治療者5年內發生耐藥率只有1.3%，但是隨著治療時間持續，特別是經過LAM治療無效轉為ETV治療的患者會有非常明顯的耐藥率提高[19]。發生耐藥性與病毒基因突變的區域有關。rtM 204V、rtl 180M、rtM2041發生突變并且任意在rtT184、rtS202，rtM250中一個點上被替換掉氨基酸就可以判斷為患者對ETV發生耐藥。如果出現同時超過兩個點被替換，那么病毒株將會成倍地降低對藥物的敏感性。

研究發現，rtT 184A/L/F/M/C突變、rtM 250V/L突變和rtS 202G突變都會表現出最高倍數的耐藥顯型（＞90倍）基因表達，基本上都會合并出現rtM 204V耐藥基因突變，而一般不會以rtM 204I基因突變為基礎框架[20]。在rtT 184I突變出現的時候，一般rtM 204I突變也會存在，這種情況對ETV的敏感度下降18倍，而帶有rtM 204I的突變株應該仍對ETV存在敏感性。同時，含有rtT 184S的耐藥株對ETV的敏感性也下降了11～14倍。雖然臨床上使用核苷酸類似物抗乙型肝炎病毒治療能夠起到抑制病毒復制和控制肝功能的效果，但是仍存在一個較為嚴重的問題就是使用藥物一段時間后會產生耐藥問題。

本研究結果顯示，240例CHB患者血清ALT水平為（80.3±24.6）U/L，血清 HBV DNA 水平為（3.2±1.4）lg IU/ml。單用應拉米夫定治療者發生耐藥突變率為40.0%，突變位點常見的為rtL80I/V、rtVl73L、rtLl80M、rtM204V/I和rtV207I，單用阿德福韋治療者發生耐藥突變率為47.8%，突變位點為rtAl81T/V、rtS213T/N、rtV214A、rtQ215S/H/P、rtl233V、rtN236T、rtP237H、rtN/H238A/K/D/S，單用恩替卡韋治療者發生耐藥突變率為14.3%，為最低，突變位點為rtM204I，單用替比夫定治療者發生耐藥突變率為41.7%，突變位點為rtI169T、rtL180M、rtT184G/S/A/I/L/F、rtS202I/G、rtM204V、rtM250V/I/L，聯合或序貫治療者發生耐藥突變率51.0%，突變位點為rtA194T；在240例CHB患者中，HVB基因型感染者21例（8.8%）、C型216例（90.0）、D型3例（1.2%）。在發生耐藥突變的91例患者中，B型6例（6.6%）、C型83例（91.2%）、D型2例（2.2%），三種 HBV 基因型耐藥突變率的差異無統計學意義（x2=1.22，P＞0.05）。在發生耐藥突變的6例B型感染者中，有2例（33.3%）發生了多重耐藥突變，在發生耐藥突變的83例C型感染者中有15例（18.1%）發生了多重耐藥突變，而D型感染者沒有發生多重耐藥突變的病例。結果表明病毒產生耐藥性之后，出現了耐藥基因變異，這些變化可能增加了導致慢性肝炎逐步向肝硬化或肝癌發展的可能性。所以，臨床上，加強檢測和分析這些基因的突變變化，及時發現耐藥基因并采取相應的措施調整治療方案，對于治療效果的提高有很大的臨床意義。