自體外周血干細胞移植治療乙型肝炎肝硬化患者臨床療效及其對外周血T淋巴細胞亞群的影響

王 禪，秦 偉，戴 勇，李曉峰，張成強

乙型肝炎肝硬化是一種常見的慢性肝病，其肝組織病理學表現為纖維組織增生、結構破壞，假小葉形成。研究發現，在急慢性肝損傷及修復過程中，干細胞的再生起著重要的作用[1，2]。近年來，干細胞移植技術在治療乙型肝炎肝硬化方面取得了一定的成就，且有相關研究發現，應用自體外周血干細胞（peripheral blood stem cells，PBSC）移植治療肝炎肝硬化患者取得了一定的療效[3，4]。自體PBSC是一種未成熟的細胞，可在一定條件下分化為具有不同功能的組織細胞，可以進行自我復制和更新。自體PBSC移植治療肝炎肝硬化主要是利用其具有多項分化潛能，可以在適當環境下向肝細胞分化的特點，該治療方法明顯提高了患者的生活質量。作為一項新技術，其應用前景較好[5，6]。本研究應用自體干細胞移植治療乙型肝炎肝硬化患者，觀察了其療效情況，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年4月～2017年4月我院治療的乙型肝炎肝硬化患者95例，男性63例，女性32例；年齡32～65歲，平均年齡（51.6±8.1）歲。診斷符合慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）[7]的標準，并經B超、CT等影像學檢查診斷為肝硬化。Child-Pugh A級33例，B級34例，C級28例。排除標準：（1）近期應用過免疫抑制劑或糖皮質激素；（2）嚴重的全身感染；（3）有家族遺傳性肝病史者。將入選患者隨機分為兩組，兩組性別（x2=0.632，P=0.426）、年齡（t=1.575，P=0.115）和 Child-Pugh 分級（x2=1.893，P=0.388）等一般資料比較，差異無統計學意義，具有可比性。患者簽署知情同意書，本研究已獲得我院醫學倫理委員會批準實施。

1.2 治療方法 給予兩組護肝、降酶和恩替卡韋抗病毒治療。部分患者在此基礎上，給予自體PBSC移植治療。給予人粒細胞集落細胞刺激因子皮下注射，連續2 d。術前1 d，行碘過敏試驗，雙側腹股溝備皮。使用德國費森尤斯公司生產的COM-TEC血細胞分離機行外周血血細胞分離，按Auto-MNC程序，安裝一次性血細胞分離管路，連接血細胞保存液及抗凝劑，機器自動檢測，預充，在患者雙側肘正中靜脈置入留置針，分離血細胞70～80 ml。采集完成后，在數字減影血管造影下經股動脈穿刺插管，經肝固有動脈造影，觀察肝內血管情況。排除肝內占位后，將采集的干細胞懸液緩慢注入肝動脈，術后拔管，穿刺點加壓包扎，返回病房，穿刺側下肢制動24 h。

1.3 臨床檢測與檢查 使用Beckman Coulter FC500全自動流式細胞儀檢測外周血T細胞亞群；使用法國Echosens公司生產的Fibroscan儀檢測肝臟硬度；采用Child-Turcotte-Pugh評分系統評價肝功能[8]；采用ELISA法檢測血清腫瘤壞死因子（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）；采用免疫透射比濁法檢測血清超敏C反應蛋白（hypersensitive C reactive protein，hs-CRP，試劑盒購于北京東亞免疫技術公司）；使用美國貝克曼庫爾特公司生產的CX7生化分析儀檢測血生化指標。

1.4 統計學分析 應用SPSS 18.0軟件行統計學分析，計量資料均符合正態分布，以（±s）表示，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料用[（n，%）]表示，采用 x2檢驗；不同時間資料的比較采用重復資料的方差分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組治療前后肝功能指標變化比較 治療前，兩組血生化指標比較無顯著性差異（P＞0.05）；在治療后3 m和6 m，移植組患者血清TBIL顯著低于，而血清ALB水平顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，表1）。

2.2 兩組治療前后外周血T淋巴細胞亞群變化的比較 治療前，兩組外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值比較均無顯著性差異（P＞0.05）；治療后，移植組CD3+、CD4+和CD4+/CD8+比值均顯著高于對照組（P＜0.05，表2）。

表1 兩組肝功能指標（±s）比較

表1 兩組肝功能指標（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05

例數TBIL（μmol/L）ALB(g/L) INR移植組 移植前 48 27.5±3.9 26.5±3.6 1.4±0.8移植3 m 48 22.7±2.5① 30.8±3.7① 1.3±0.6 6 m 48 16.4±1.2① 35.2±4.0① 1.2±0.5對照組 治療前 47 27.9±4.1 26.1±3.5 1.3±0.9移植3 m 47 25.4±3.7 28.3±3.9 1.2±0.7 6 m 47 22.5±2.6 31.6±3.7 1.3±0.4

表2 兩組外周血T淋巴細胞亞群（±s）比較

表2 兩組外周血T淋巴細胞亞群（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05

數CD3+（%）CD4+（%）CD4+/CD8+比值移植組 治療前 48 50.8±5.1 33.2±4.5 0.9±0.1移植3 m 48 61.7±7.4① 38.1±3.3① 1.4±0.1①6 m 48 67.9±6.5① 42.7±3.8① 1.5±0.2①對照組 治療前 47 51.4±5.6 32.7±5.0 0.9±0.2移植3 m 47 55.3±7.2 34.2±3.1 1.3±0.1 6 m 47 60.3±5.5 38.2±3.5 1.4±0.1例

2.3 兩組治療前后肝硬度和Child-Pugh評分的比較 治療前，兩組肝硬度和Child-Turcotte-Pugh評分比較無顯著性差異（P＞0.05）；治療后，移植組肝硬度和Child-Pugh評分均顯著低于對照組（P＜0.05，表3）。

表3 兩組肝硬度和Child-Turcotte-Pugh評分（±s）比較

表3 兩組肝硬度和Child-Turcotte-Pugh評分（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05

例數 肝硬度（kPa） Child-Pugh評分移植組 治療前 48 9.6±0.3 9.6±1.9移植 3 m 48 8.3±0.2① 7.4±1.6①6 m 48 7.1±0.1① 5.5±1.5①對照組 治療前 47 9.8±0.3 9.3±2.1移植3 m 47 8.7±0.2 8.3±2.3 6 m 47 7.9±0.1 7.4±2.3

2.4 兩組血清細胞因子水平比較 治療前，兩組血清TNF-α、hs-CRP和IL-6水平比較無顯著性差異（P＞0.05）；治療后，移植組血清細胞因子水平均顯著低于對照組（P＜0.05，表4）。

表4 兩組血清細胞因子水平（±s）比較

表4 兩組血清細胞因子水平（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05

IL-6（pg/mL）移植組 治療前 48 48.5±11.4 12.3±3.5 37.5±3.5移植3 m 48 36.5±9.6① 9.8±2.9 24.5±4.3①6 m 48 28.0±8.7① 6.0±2.2① 18.9±5.6①對照組 治療前 47 46.9±12.8 11.8±4.2 35.6±4.0移植3 m 47 41.5±9.8 10.3±4.0 30.9±6.3 6 m 47 36.2±8.6 8.7±3.5 25.2±7.9例數TNF-α（pg/mL）hs-CRP（mg/L）

3 討論

由乙型肝炎病毒感染而發展的終末期肝病往往都存在嚴重的肝硬化，可導致患者消化道出血、門靜脈高壓、自發性細菌性腹膜炎和肝性腦病等嚴重并發癥而危及生命[9，10]。相關研究指出，乙型肝炎病毒感染可造成肝臟損害，免疫應答反應失衡導致機體炎性反應，這些因素共同作用的結果是導致疾病進入終末期[11，12]。乙型肝炎病毒侵襲機體時會產生大量的炎性因子或代謝產物，同時激活人體免疫應答反應，在清除病毒的同時引起肝臟損傷[13，14]。在乙型肝炎病毒感染引起慢性肝炎的發病過程中，往往伴有TNF-α、hs-CRP和IL-6等細胞因子的參與。機體在清除乙型肝炎病毒的過程中，T淋巴細胞亞群具有重要的作用。所以，檢測相關炎性因子和外周血T淋巴細胞亞群對于治療乙型肝炎肝硬化患者具有重要的臨床意義[15，16]。應用恩替卡韋和阿德福韋酯等抗病毒治療，只能移植病毒復制，對于已經存在的肝硬化往往不能奏效。自體干細胞移植是近年來興起的一種新興技術。干細胞經體外培養、基因修飾和誘導，再回輸體內，可能歸巢至病變部位并發育成肝樣細胞而發揮生理作用。這種方法已經廣泛試用于對肝炎肝硬化患者的治療[17，18]。

本研究在應用恩替卡韋和基礎治療改善患者一般情況的基礎上，對部分患者再進行自體PBSC經肝動脈移植治療，結果顯示，在治療后3個月和6個月時，患者血清膽紅素水平顯著降低，而血清白蛋白水平明顯升高，表明自體干細胞移植可能通過合成多種細胞因子，促進了受損肝細胞的修復，肝功能得到顯著改善。經自體PBSC移植術治療的患者肝硬度值和Child-Pugh評分顯著降低，說明自體PBSC移植術能改善肝臟的儲備功能，控制肝硬化的進展速度，提高肝硬化患者的生存質量。此外，患者肝功能在得到明顯改善后，食欲下降、乏力、腹脹和腹水等癥狀都有了明顯的改善，顯示出使用自體外周血干細胞移植在改善肝功能和臨床癥狀方面更具有優勢，其安全性也高。

本研究還顯示，在使用自體PBSC移植術后3個月和6個月，患者外周血CD3+、CD4+細胞百分比和CD4+/CD8+細胞比值均有所提高，表明干細胞移植可以改善患者外周血T淋巴細胞亞群的紊亂。外周血CD4+細胞不能有效抑制自身免疫反應，將導致免疫性肝損害加重，可能是由于T淋巴細胞亞群失衡可產生大量的炎性因子，繼而加重肝細胞受損，而自體PBSC移植術治療是一種把健康的干細胞移植到患者體內，從而達到修復之前受損的肝細胞，促進外周血T淋巴細胞亞群紊亂的改善。本研究結果還顯示，自體PBSC移植后的患者血清TNF-α、hs-CRP和IL-6水平降低更明顯，考慮與自體干細胞移植能有效調節T淋巴細胞亞群紊亂，增強了細胞免疫力，繼而有效降低機體的炎癥反應，而在積極改善患者局部微環境后，也可減輕肝細胞的進一步損傷，這也可能是應用該方法治療的患者療效更顯著的內在機制之一[19，20]。當然，干細胞移植治療的復雜機制還需要深入研究。