肝癌組織IFITM3蛋白表達水平及其與肝細胞癌患者手術切除術后肝內腫瘤復發的相關性分析*

代曉楠,呂金燕，翁文采,鄭麗麗

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國最為常見的一種惡性程度很高的惡性腫瘤[1]。調查顯示，大多數肝癌很容易發生肝內或遠處器官腫瘤轉移，即便是在能接受手術切除治療的早期患者，術后3 a復發率也超過50%[2，3]。因此，針對肝癌復發和轉移機制的研究一直是醫學界關注的熱點。研究指出，腫瘤的轉移是一個由多基因參與的過程，涉及多步驟和多環節，每個階段都會受到一個或多個基因/蛋白的調控，而干擾素誘導跨膜蛋白（interferon-induced transmembrane protein，IFITM3）基因家族成員就在其中發揮著重要的作用[4，5]。IFTIM3基因是IFITM家族中的一員，有研究證實該基因編碼的蛋白參與了結腸癌和乳腺癌等惡性腫瘤的發生和發展，但有關其在肝癌轉移復發中的作用及具體機制尚未形成明確的認知[6，7]。本研究采用Western blot法和免疫組化（SP）法檢測了肝癌組織IFITM3蛋白表達情況，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年4月～2016年2月在我院接受根治性手術切除治療的HCC患者43例，男性31例，女性12例；年齡43～76歲，平均年齡（55.63±3.92）歲。根據全國第四屆肝臟外科學會會議修訂的HCC診斷標準診斷，且經術后組織病理學檢查證實。其中伴隨肝內衛星轉移灶者29例，無肝內轉移灶者14例；低分化癌21例，中分化癌11例，中高分化癌11例。所有患者均為首次發病，手術前未接受過任何放化療。術中取肝癌組織和距離腫瘤2 cm以上的癌旁組織，置于液氮中保存。本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑 BX41型顯微鏡（OLYPMPUS，日本），YSP-300生物組織自動脫水機（Leica，德國），紫外可見分光光度計（Pharmacia Biotech，美國），免疫組化染色抗體孵育盒（中杉，中國），Western blot垂直電泳儀（Eppendorf，德國），熒光定量 PCR 分析儀 7500（ABI，美國），CO2恒溫培養箱（醫用設備有限公司，中國）。兔抗人 IFITM3蛋白多克隆抗體和鼠抗人 β-catin蛋白單克隆抗體（Proteintech，美國），酶標羊抗鼠 IgG 聚合物、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠 IgG、DAB顯色試劑盒（中杉，中國），蘇木素（上?；瘜W試劑有限公司），Western Blot制膠盒和膠片（長城生物技術有限公司），PBS緩沖液（福州邁新生物技術開發有限公司），兩步法蛋白提取試劑盒（北京普利萊生物技術有限公司），SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、Western一抗稀釋液（江蘇碧云天）。

1.3 組織IFITM蛋白表達檢測 采用Western blotting法，取剪碎后的癌組織和癌旁組織，加入RIPA裂解液，收集組織蛋白，采用BCA法檢測總蛋白濃度。將等量的總蛋白加入各孔中進行垂直電泳，卸膠，轉膜，用三蒸水漂洗，在封閉液中搖床封閉2 h，以β-actin作為內參照。三蒸水漂洗，加入一抗稀釋液，4℃下過夜，室溫下加TBST，搖床上清洗，10 min×3次；加TBST漂洗從一抗中取出的膜，10 min×3次，加入二抗稀釋液，室溫下孵育2 h，室溫下在搖床上TBST清洗，10 min×3次；采用HRP-ECL發光法顯影。對顯影的條帶進行拍照，讀取IFITM和β-actin灰度值，計算兩者的灰度值比。另采用SP法檢測，取經福爾馬林固定的癌組織和癌旁組織，石蠟包埋、切片，置于60℃烘箱中烤片過夜，室溫下將切片置于3%O2H2孵育20 min，PBS沖洗3次，每次間隔3 min。加入一抗50μl，37℃下孵育25 min，PBS沖洗3次，每次間隔3 min；加入二抗50μl，室溫下孵育25 min，PBS沖洗3次，每次間隔3 min；加入DAB顯色劑50μl顯色2 min，自來水沖洗，蒸餾水沖洗，蘇木素復染2 min，PBS返藍1 min，酒精脫水2 s，干燥后用中性樹膠封片。判斷IFITM3陽性細胞標準：胞質呈棕黃色顆粒狀為IFITM陽性染色細胞。在400倍顯微鏡下判斷免疫組化檢測結果，隨機選擇每張切片的5個視野進行觀察，計算細胞陽性率和染色強度。由兩名病理科醫生采用雙盲法對每張切片進行觀察閱片，取平均值。

1.4 隨訪 所有入選患者均接受根治性手術切除腫瘤，隨訪1年，術后每3個月檢測血清甲胎蛋白（AFP），行腹部B超檢查。當發現肝內有可疑的占位性病灶時，則進行腹部CT檢查，根據檢查結果確認復發。

1.5 統計學分析 應用SPSS 23.0軟件包進行統計學處理，計量資料以±s描述，采用配對資料的t檢驗，IFITM3蛋白表達陽性率的比較采用x2檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 肝癌組織和癌旁組織IFITM3蛋白的表達情況 Western Blot法檢測結果顯示肝癌組織IFITM3表達水平為（1.2386±0.1901），顯著強于癌旁組織的（0.9496±0.0995），差異顯著（t=8.832，P=0.000）。此外，不同腫瘤大小、TNM分期、有無肝內衛星轉移灶腫瘤間IFITM3表達水平存在顯著性差異（P＜0.05），而在不同性別、年齡和血清AFP水平患者間比較無顯著性差異（P＞0.05，表1）。經免疫組化法檢測肝癌組織和癌旁組織IFITM3表達，可見IFITM3陽性細胞漿呈棕黃色顆粒狀，其中肝癌組織IFITM3蛋白表達陽性率為72.1%（31/43），顯著高于癌旁組織的 14.0%（6/43，x2=29.647，P=0.000）。此外，中分化肝癌組織IFITM3蛋白陽性率為90.9%（10/11），低分化肝癌組織為 95.2%（20/21），均明顯高于高分化組的9.1%（1/11，x2=14.727，P=0.000；x2=23.748，P=0.000）；伴肝內轉移組患者 IFITM3蛋白陽性率為93.1%（27/29），而不伴肝內轉移組為28.6%（4/14），兩者比較差異顯著（x2=19.544，P=0.000，圖1、圖2）。

表1 不同臨床和病理學特征患者肝癌組織IFTIM3表達水平（±s）比較

表1 不同臨床和病理學特征患者肝癌組織IFTIM3表達水平（±s）比較

例數 IFITM3/β-actin t P性別 1.528 0.134男31 1.3199±0.1362女12 1.2394±0.1971年齡（歲） 0.695 0.491＞50 30 1.2651±0.1994≤50 13 1.2213±0.1639 AFP（μg/l） 1.424 0.162＞400 19 1.2014±0.1761≤400 24 1.2869±0.2094肝內轉移 24.053 0.000有29 1.4936±0.0337無14 1.1093±0.0718 TNM分期 7.825 0.000Ⅰ/Ⅱ期 14 1.0996±0.0573Ⅲ/Ⅳ期 29 1.4002±0.1374腫瘤直徑（cm） 8.310 0.000≤5 17 1.1032±0.0617＞5 26 1.4025±0.1394

圖1 肝癌組織IFITM3蛋白表達情況（SP，400×）

圖2 癌旁組織IFITM3蛋白表達情況（SP，400×）

2.2 術后復發與無復發的HCC患者癌組織IFITM3蛋白表達情況比較 對43例患者進行術后隨訪，發現1年內肝內腫瘤復發患者21例（48.8%）；術后復發組癌組織IFITM3蛋白陽性率為81.0%（17/21），未復發組為22.7%（5/22），兩者比較差異具有統計學意義（x2=14.578，P=0.000）。

3 討論

肝癌的復發轉移是影響肝癌患者生存時間，導致患者死亡的重要原因，但目前有關肝癌復發轉移的具體機制尚不清楚，尤其是在分子調控層面[8]。研究指出，腫瘤的轉移復發從分子水平大致有原發腫瘤細胞生長增殖、癌細胞在黏附分子介導下與細胞外黏附、癌細胞釋放大量水解細胞外基膜和基質的蛋白水解酶、組織被水解酶破壞后癌細胞通過組織間隙、血管和淋巴管浸潤，發展至遠處，形成新生的腫瘤組織微血管，癌細胞在新的環境中生長和增殖[9-11]。在上述過程中基因或蛋白的調控至關重要，其中IFITM基因家族有可能在細胞黏附、免疫細胞信號傳導、癌細胞遷移等多個階段都發揮著重要的作用[12]。

IFITM3基因是該家族的成員之一，其位于人11號染色體上，堿基長度約為1.5 kb，可被Ⅰ-Ⅱ型干擾素誘導，編碼跨膜蛋白3[13]。該基因最早被發現于經干擾素治療的神經細胞瘤細胞，其不僅可在細胞膜上表達，還被發現存在細胞質中[14]。IFITM3已經明確在生殖細胞成熟和歸巢、免疫細胞調節、細胞增殖、體節形成和心臟發育等不同細胞進程中發揮著作用。它還可與IFITM1和IFITM2等一起抵抗流感病毒、HIV等多種病毒的侵入，具有抗病毒的作用[15-17]。最新的研究指出，IFITM3在多種腫瘤的發生和侵襲中也發揮著作用。IFITM3在結腸癌中呈高表達，且表達水平與腫瘤分期密切相關，在伴隨淋巴結轉移患者中的表達水平更高[18]。增殖和侵襲等生物學功能明顯活躍的腫瘤細胞IFITM3表達增強，因此有學者建議將其表達水平作為判斷結腸癌患者預后的指標。在惡性神經膠質瘤，IFITM3蛋白表達呈陽性，且其表達水平與腫瘤惡性程度呈正相關[19]。同時，體外實驗顯示該基因表達水平降低后，膠質瘤細胞的克隆形成、增殖和遷徙能力都明顯降低。上述研究結果均說明，IFITM3可能是一種腫瘤的致癌基因，其在腫瘤的發生和發展中具有重要作用。

本研究則進一步探討了IFITM3蛋白在肝癌組織中的表達情況及其與肝癌復發之間的關系，結果顯示，肝癌組織IFITM3蛋白表達陽性率和蛋白表達水平明顯高于或強于癌旁組織，其中肝癌組織IFITM3蛋白陽性率為72.1%，而癌旁組織為14.0%（6/43，P＜0.05）。進一步分析不同臨床特征患者肝癌組織該基因表達水平可見腫瘤＞5 cm，TNM Ⅲ-Ⅳ期和有肝內復發者IFITM3蛋白表達水平要明顯強于腫瘤≤5 cm、TNMⅠ-Ⅱ期和無肝內復發者（P＜0.05）。此外，低分化和中分化肝癌組織IFITM蛋白陽性率均要明顯高于高分化組，伴肝內衛星灶者陽性率也要明顯高于無肝內衛星灶者（P＜0.05），提示該基因在肝癌組織呈現高表達，其表達水平與肝癌的惡性程度呈正相關，與有關研究[20]結論一致。我們進一步對接受根治術的HCC患者進行1年隨訪，結果顯示HCC復發組癌組織IFITM3蛋白陽性率為 81.0%（17/21），未復發組為 22.7%（5/22），兩者比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。綜合上述結果，我們認為IFITM3基因在肝癌的發生、發展、復發等過程中發揮著重要作用，其在肝癌組織中的高水平表達在一定程度上會促進癌細胞的生長、增殖，提高其侵襲和轉移能力，這可能成為肝癌分子靶向治療的一個新方向。