動脈灌注化療栓塞聯(lián)合放射粒子植入治療原發(fā)性肝癌患者療效及其對肝組織TRF1和TRF2表達的影響*

陳 向，汪寶林，吳 琛，唐勁草，張 弛，褚朝順

動脈灌注化療栓塞術(shù)（TACE）是針對肝臟腫瘤的有效治療方法，療效確切，已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，但單純TACE治療的遠期療效并不理想[1～3]。腫瘤病灶內(nèi)125I放射粒子植入是一種可以對病灶精確定位的新型放療手段，能夠有效提高局部病灶的放射劑量。目前，關(guān)于TACE聯(lián)合放射粒子植入治療原發(fā)性肝癌（PLC）患者的臨床應(yīng)用報道較多，且療效肯定[4]。端粒重復(fù)序列結(jié)合因子（telomeric repeat binding factor 1/2，TRF1/2）是調(diào)節(jié)端粒結(jié)合蛋白，對維持端粒的正常結(jié)構(gòu)和功能非常重要[5]，對于腫瘤細胞DNA復(fù)制、染色體運動和端粒長度的調(diào)節(jié)等生物學活動也具有重要的意義，與多種腫瘤的發(fā)生、病情進展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]。本研究探討了TACE聯(lián)合放射粒子植入術(shù)治療的PLC患者肝組織TRF1和TRF2表達的變化，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年12月～2015年12月我院和南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院接受治療的PLC患者108例，男66例，女42例；年齡38～71歲。符合原發(fā)性肝癌診斷標準[7]。腫瘤形態(tài)為彌漫型18例，結(jié)節(jié)型40，塊狀型50例；Child A 級30例，B級66例，C級12例。納入患者均未接受過任何放療和化療治療，預(yù)計生存時間大于6個月，經(jīng)影像學檢查未發(fā)現(xiàn)其它部位轉(zhuǎn)移。排除標準：（1）存在TACE治療禁忌證；（2）血白細胞計數(shù)小于3.0×109/L、血小板計數(shù)小于80×109/L；（3）存在心血管系統(tǒng)疾病或腎功能損害者；⑷存在其他部位惡性腫瘤。采用擲硬幣法將患者隨機分為對照組54例和觀察組54例，兩組年齡、性別、腫瘤形態(tài)、Child分級等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究方案經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準。患者簽署知情同意書。

1.2 治療方法 在對照組，行TACE治療，行局部麻醉后，經(jīng)股動脈穿刺插入導(dǎo)管，造影確認腫瘤位置、大小、數(shù)目，明確相關(guān)供血動脈情況，緩慢注射吡柔比星（深圳萬樂藥業(yè)有限公司，國藥準字H10930105）20～40 mg，奧沙利鉑（江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司,國藥準字H20051985）50 mg和碘化油，取吡柔比星20 mg與48%碘化油10 ml比例混合，碘化油用量為10～15 ml。術(shù)后采取常規(guī)護肝治療；在觀察組，行放射粒子植入術(shù)聯(lián)合TACE治療，在TACE治療1周后，將患者體位固定，行CT平掃，明確腫瘤大小、位置、癌旁組織結(jié)構(gòu)，在體表標記。將CT掃描數(shù)據(jù)、125I治療劑量和125I放射粒子活性等參數(shù)傳輸至計算機系統(tǒng)。采用Dany CT確定臨床治療靶區(qū)，并根據(jù)CT導(dǎo)航系統(tǒng)進行定位穿刺，確認針尖穿刺至治療靶區(qū)后，通過針鞘將已確定劑量的125I放射粒子植入。再次行CT掃描復(fù)查，觀察放射粒子分布情況，術(shù)畢，拔出穿刺針，對穿刺部位進行消毒、包扎。兩組患者均實施3～4次TACE治療，觀察組僅進行1次放射粒子植入，治療結(jié)束后隨訪12 m。

1.3 臨床療效評估 采用世界衛(wèi)生組織關(guān)于實體腫瘤療效的評定標準[8]評定療效，即完全緩解（CR）：所有病灶消失；部分緩解（PR）：病灶體積減少至少50%；病情穩(wěn)定（SD）：體內(nèi)腫瘤病灶體積減少小于50%或增加不大于25%；進展或惡化（PD）：病灶體積增加至少25%或出現(xiàn)新的病灶。客觀緩解率(RR)為CR和PR之和除以總例數(shù)（×100%）。

1.4 血清腫瘤標志物檢測 采用ELISA法測定血清癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）和甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）水平，試劑盒購自聯(lián)科生物科技有限公司。

1.5 肝癌組織TRF1和TRF2表達檢測 分別于治療前和治療1月后行肝活檢穿刺檢查，獲取肝組織，采用免疫組化染色（S-P）法檢測。鼠抗人TRF1單克隆抗體和兔抗人TRF2單克隆抗體及其配套試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。由兩名病理科醫(yī)生閱片，遵循隨機單盲原則，在400倍下避開切片邊緣選取5處不重疊視野觀察，計數(shù)TRF1和TRF2陽性細胞數(shù)。陽性判斷標準[9]：細胞漿或細胞核內(nèi)見棕黃色或棕色顆粒分布者，判定為陽性；陰性判斷標準：胞漿內(nèi)無棕黃色顆粒染色為陰性。采用半定量綜合評分法對TRF1和TRF2的表達進行評估，評估標準：染色積分=染色強度分數(shù)×染色細胞百分比；細胞染色計分：0分為無染色細胞，1分為陽性細胞小于10%；2分為染色陽性細胞在11%～50%；3分為50%～75%，4分為超過75%的細胞染色陽性；染色強度：0分為無染色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。綜合評分：0～2分為不表達，記為陰性；3～5分為弱表達，記為弱陽性；6～8分記為中等陽性；9～12分記為強陽性。

1.6 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對本研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,計數(shù)資料采用x2檢驗，計量資料以（±s）表示，采用 t檢驗。以 P＜0.05 被認為差異存在統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效比較 在治療后3 m，觀察組客觀緩解率顯著高于對照組（x2=4.441，P＜0.05，表1）。患者男性，46歲。肝右葉見巨大占位，約13.3×16.1 cm，邊界欠清，增強呈快進快出，內(nèi)見壞死區(qū)，肝門部見多發(fā)稍大淋巴結(jié)；在介入治療術(shù)后，肝右葉巨大占位較前縮小，最大截面約為10.1×13.3 cm，周圍肝實質(zhì)密度降低，病灶內(nèi)可見斑片狀致密影和少許氣體樣密度，增強后未見明顯強化，肝門處和腹主動脈周圍可見多發(fā)稍大淋巴結(jié)。

表1 兩組近期療效[(n)%]比較

2.2 兩組血清CEA和AFP水平比較 在治療3月時，觀察組血清CEA和AFP水平顯著低于對照組（P＜0.01，表2）。

表2 兩組血清CEA和AFP水平(±s)比較

表2 兩組血清CEA和AFP水平(±s)比較

與對照組比，①P＜0.05

例數(shù) CEA(ng/ml) AFP(μg/L)對照組 治療前 54 520.6±55.2 2420.2±290.3治療后 54 312.5±33.9 1080.1±121.3觀察組 治療前 54 526.1±51.1 2371.4±245.2治療后 54 273.7±38.1② 820.4±130.3②

2.3 兩組治療前后肝組織TRF1和TRF2表達的比較 觀察組癌旁肝組織TRF1表達量為（9.7±2.3），顯著高于癌組織的【（4.2±1.8），P＜0.01】，而觀察組癌組織TRF2表達量為（9.2±2.2），顯著高于癌旁肝組織的【（3.8±2.6），P＜0.01，圖1～圖3】。

圖1 癌旁肝組織TRF1陽性表達在細胞漿中可見棕褐色顆粒（SP，400×）

圖2 肝癌組織TRF1呈輕度陽性表達（SP，400×）

圖3 肝癌組織TRF2陽性表達在細胞核和細胞漿中可見棕褐色顆粒（SP，400×）

2.4 兩組生存率比較 觀察組1 a生存率顯著高于對照組 [96.3%（52/54）對 85.2%（46/54），x2=3.967，P=0.046]。

3 討論

本研究采用TACE聯(lián)合放射粒子植入術(shù)治療PLC患者客觀緩解率為79.6%，明顯高于對照組的61.1%。分析認為肝動脈為腫瘤的主要供血動脈，TACE通過對肝動脈注入化療藥物，對腫瘤細胞具有直接的殺傷作用，同時還能阻斷病灶的供血，促進腫瘤凋亡[10]。放射粒子植入術(shù)能夠精確定位腫瘤靶區(qū)域，局部大劑量放療能夠大大提高臨床療效。兩者作用機制不同，聯(lián)合使用能產(chǎn)生發(fā)揮協(xié)同作用，且經(jīng)TACE治療后能夠有效改善腫瘤細胞對放療的敏感性，進而提高臨床治療效果[11，12]。

研究發(fā)現(xiàn)，細胞端粒功能異常是導(dǎo)致細胞異變，繼而引發(fā)癌癥發(fā)生的重要原因[13，14]。端粒的結(jié)構(gòu)和功能與細胞在增殖過程中DNA復(fù)制、細胞老化、細胞程序性死亡密切相關(guān)。惡性腫瘤細胞核內(nèi)具有生物學活性較高的端粒酶，導(dǎo)致端粒的結(jié)構(gòu)和功能異常，實現(xiàn)腫瘤細胞在一定程度上的持續(xù)性增長，是導(dǎo)致病情發(fā)生和惡化的重要因素。TRF1和TRF2是影響細胞端粒結(jié)構(gòu)、活性和功能的重要蛋白。TRF1能夠特異性調(diào)節(jié)結(jié)合DNA的端粒數(shù)量，從而對端粒長度實現(xiàn)負性調(diào)節(jié)作用，而TRF2的生物學功能是維持端粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，保持端粒長度的動態(tài)平衡，影響細胞的增殖和凋亡。國外研究表明，惡性腫瘤組織TRF1的表達明顯降低而TRF2較正常組織明顯增高[15]。國外研究學者發(fā)現(xiàn)PLC患者TRF1和TRF2異常表達為PLC發(fā)病的獨立危險因素，TRF1和TRF2表達水平與臨床分期密切相關(guān)。他們認為對患者血TRF1和TRF2含量進行動態(tài)監(jiān)測，對于疾病的診斷、病情及預(yù)后的評估具有重要意義[16]。Bouhlel L et al[17]指出，非小細胞肺癌患者血TRF2水平較健康對照人群明顯增高。因此，探討臨床常用治療方案對肝癌患者TRF1和TRF2表達的影響，對于臨床治療以及預(yù)后預(yù)測具有重要意義。采用TACE聯(lián)合125I治療能夠明顯調(diào)節(jié)患者肝組織TRF1和TRF2表達。原發(fā)病灶腫瘤邊緣血管重建和腫瘤細胞增殖等活動中均有TRF1和TRF2的參與，進而影響腫瘤細胞增殖過程中的DNA復(fù)制。肝癌患者外周血TRF2呈異常增高，TRF1明顯下降。肝動脈為肝腫瘤主要的血供來源，TACE將化療藥物直接灌注到相關(guān)腫瘤供血血管，阻斷病灶血供，抑制血管增生，促進細胞凋亡，相關(guān)因子明顯下降。TACE聯(lián)合放射粒子植入術(shù)治療患者病灶治療區(qū)域局部放療劑量較高，射線能直接破壞腫瘤細胞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，另一方面通過放射治療使水分子電離生成自由基，對腫瘤細胞DNA同樣具有殺傷作用，能夠有效抑制腫瘤細胞的分裂、生長，能防止病情的惡化和轉(zhuǎn)移，且對于病灶邊緣區(qū)域內(nèi)的殘留組織供血，TACE無法直接阻斷，而放療則可以有效殺滅該區(qū)域的腫瘤細胞。此外，相關(guān)研究已經(jīng)證實125I放射粒子植入能夠改善肝癌患者機體免疫功能，增強自身防御機制[18]。兩種方案聯(lián)合治療無交叉耐藥，同時能夠提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，增強化療的療效，抑制腫瘤血管的新生，縮小病灶體積，改善患者的預(yù)后。