miR-127-3p對C2C12細胞成肌分化和轉錄組的影響

宋天增,李 杰，馬金英, 蔣 婧，王高富， 付 琳，周 鵬，馬友記，任航行

(1. 西藏自治區農牧科學院 畜牧獸醫研究所，拉薩 850009； 2. 重慶市畜牧科學院 草食牲畜研究所 重慶榮昌 402460；3.甘肅農業大學 動物科學技術學院，蘭州 730070)

骨骼肌的形成是一個非常復雜的生物學過程，包括成肌決定，成肌細胞增殖，細胞周期的退出，肌肉特異性基因的表達，肌細胞融合形成多核肌管，多核肌管再經過一系列發育變化，最后分化成為具有功能的成熟肌纖維[1-2]。這些復雜過程的順利進行不僅受許多編碼蛋白的因子調節，如成肌調節因子家族(MRFs)、肌細胞增強子因子2家族(MEF2)和對框基因(Pax)家族，而且還受到非編碼RNAs的調控，如microRNAs(miRNAs)。由基因組中的非蛋白質編碼區或內含子所編碼的miRNAs在轉錄后水平調控基因表達，并在肌細胞的增殖和分化過程中發揮重要作用[3-5]。調控成肌分化的miRNAs可以分為兩類：一類是促進分化，包括miR-1[6]、miR-133[7]、miR-206[8]、miR-486[8]、miR-181[9]、miR-148a[10]、miR-214[11]、miR-26a[12]、miR-27b[13]、miR-378[14]和miR-322/424/503[15]等。另一類是抑制分化，包括miR-125b[16]、miR-155[17]、miR-199a-3p[18]、miR-186[19]、miR-221/222[20]和miR-669a/669q[21]等。但這些僅僅是非編碼RNA的冰山之一角，大量未知功能的miRNAs亟需鑒定。筆者前期用高通量測序(RNA-Seq)法對Texel羊(MSTN突變型)與烏珠穆沁羊(MSTN野生型)胎兒骨骼肌中的miRNA進行轉錄組測序，分析發現miR-127-3p與miR-1/206/133均屬骨骼肌高表達miRNAs，且miR-127-3p在 2 個品種羊骨骼肌中差異表達[22]，暗示miR-127-3p可能參與羊骨骼肌的生長發育調控。Yang 等[23]和Li等[24]的研究結果表明，miR-127-3p參與骨骼肌細胞的分化調控，但miR-127-3p調節成肌分化的作用機制還不清楚。本研究以表達miR-127-3p的慢病毒載體轉染分化期的C2C12成肌細胞，旨在探究miR-127-3p表達變化對C2C12細胞生肌分化的作用，及其在轉錄組水平上對基因表達的影響效應，為進一步闡明miRNA的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

DMEM培養基、胎牛血清(FBS)、馬血清(HS)、青鏈霉素雙抗、25 g/L胰酶、D-PBS均購自Gibco；6孔板、培養皿、15 mL離心管購自Corning；Lipofectamine 2000：美國Invitrogen公司；DAPI：瑞士Roche公司; SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-qPCR 和SuperScript Ⅲ Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit：美國Invitrogen公司；TaqMan MicroRNA Reverse Transcription，TaqMan MicroRNA Assays和TaqMan Universal qPCR Master Mix Ⅱ：美國ABI公司；miR-127-3p 慢病毒表達載體：美國ABI公司；Trizol試劑：美國Invitrogen公司；倒置熒光相差顯微鏡：日本Olympus公司；Countess Ⅱ FL全自動細胞計數儀(Life Technologies)。C2C12 細胞購買于中國中科院上海細胞庫。

1.2 C2C12細胞培養及轉染miR-127-3p 慢病毒載體

小鼠 C2C12 細胞培養在生長培養基 GM(DMEM+10%FBS+1% 雙抗)，待細胞匯合度至 80%左右時，加入配制的分化培養基 DM(DMEM+2%HS+1% 雙抗)，隔天更換新鮮培養基。在 37 ℃，φ=5% CO2的條件下連續培養 5 d。首先用適量 opti-MEM 溶解 miR-127-3p 慢病毒表達載體或陰性對照(miR-NC)，保持其濃度為 100 nmol/L，按照 Lipofectamine 2000 的說明書稀釋脂質體。選擇生長狀態良好的分化細胞，顯微鏡下觀察其狀態并統計細胞數目，確保初始階段處理組與對照組的細胞數一致。轉染具體步驟：首先將轉染試劑 Lipofectamine 2000 與 Opti-MEM 2 種溶液輕輕吹打至混勻，室溫孵育 5 min 后，將慢病毒表達載體與對照載體分別加入脂質體混合液，輕輕吹打，使脂質體充分接觸載體并將其完全包裹，均勻分布。待室溫靜置 20 min 后，逐滴加入培養皿中，輕微搖晃，使混合物分布均勻。為減少轉染試劑的毒性，轉染 12 h 后更換新鮮培養基。轉染 48 h 后即可進行后續相關試驗。轉染過程及試劑用量按照 Lipofectmaine 2000 轉染試劑說明書進行。

1.3 RNA-Seq測序及數據處理

收集分化第5天處理組(OE)與陰性對照組(NC)的C2C12細胞，每個處理取3份細胞RNA樣品。TRIzol 法提取細胞總RNA，10 g/L瓊脂糖電泳和分光光度計(Implen, Los Angeles, CA, USA)檢測RNA質量，質量合格后委托北京諾禾致源科技有限公司在Illumina Hiseq 2000 平臺進行RNA-Seq測序分析。6 個樣品構建的測序文庫所得的原始數據經過濾(包括去掉接頭序列、含10% 以上未知堿基的Reads，及低質量的Reads)，計算過濾后每個測序文庫的Phred值(Q20，Q30) 和GC含量，得到有效數據(Clean reads)用于后續分析。對所得的Clean reads在小鼠參考基因組上應用TopHat v2.0.9[25-26]和Scripture(Beta2)[27]進行比對和定位，應用Cuffdiff(v2.1.1)軟件計算每個基因的表達量(FPKM，Fragments per kb for a million reads)[28]。用DESeq軟件鑒定處理組與對照組細胞的差異表達基因，篩選標準為校正后的P值(padj )< 0.05。

1.4 Real-time qPCR

用Trizol法從C2C12細胞中提取總RNA，mRNA和miRNA分別用SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-qPCR和TaqMan MicroRNA Reverse Transcription試劑盒反轉錄成cDNA，再分別進行qRT-PCR分析。miR-127-3p按探針法miRNA定量試劑盒說明操作，U6為內參基因，體系如下:50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環。每個樣品做3次重復。成肌分化標志基因MyoD(F:GGC- TCTCTCTGCTCCTTTGA，R:GTAGGGAAG- TGTGCGTGCTC)、MyoG(F：GCAGGCTCAAGAAAGTGAATG，R:AGGCGCTCAATGTACTGGAT)和Myosin(F:AGGCACCTGCTGAAGAAGAC，R:CCTCGAAGGTCTGTGACTCC)的定量以GAPDH(F:TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG，R:AGGTGGAA-GAGTGGGAGTTG)為內參基因。mRNA與miRNA的相對定量表達均采用2-ΔΔCt法計算。

1.5 統計方法

應用SAS 8.0軟件中的t-test方法檢驗qPCR分析結果。

2 結果與分析

2.1 miRNA表達載體的轉染效率及其對C2C12細胞分化的效應

研究結果表明，miRNA載體的轉染效率達到95%(P<0.01) (圖1-A)，說明miR-127-3p 載體轉染細胞效率較高，可以用于后續試驗；基因表達與細胞形態學分析表明，過表達miR-127-3p可顯著提高細胞成肌分化標志基因MyoG和Myosin的表達(P<0.01)(圖1-B)，促進細胞的成肌分化(圖1-C)。

qRT-PCR法檢測miR-127-3p(A)與成肌標志基因MyoD，MyoG和Myosin(B)的表達。數據表示為“平均值±標準差”(n=3),*P<0.05, **P<0.01。在分化第5天分別觀察C2C12細胞的形態學情況，比例尺= 100 μm(C) MiR-127-3p(A), myogenic marker genesMyoD，MyoGandMyosin(B) expression were measured by qRT-PCR.The data are the “mean+SD”(n=3). *P<0.05, **P<0.01 .Morphological features of myotubes at 5th day of differentiating C2C12 cells. Scale bar = 100 μm(C)

圖1miRNA載體轉染效率及其對C2C12細胞的分化效應
Fig.1TheefficiencyandeffectofmiRNAexpressionvectoronmyogenicdifferentiationinC2C12cells

2.2 過表達miR-127-3p對C2C12細胞轉錄組的影響

在分化介質中，C2C12成肌細胞分別轉染miR-127-3p 表達載體和對照組(NC)慢病毒載體后第 5 天，對兩組細胞總RNA在Illumina平臺進行RNA-seq深度測序。6 個文庫(每組 3 份細胞樣本)的測序原始數據(Raw reads)經過濾后共獲得 21 Gb的有效數據(Clean reads)，數據質控檢驗合格(平均Q20>96%，Q30>92%)，說明本次測序數據質量較高，可用于后續差異基因分析。基因表達分析發現，11 761 個基因在過表達組(OE)與對照組(NC)細胞共同表達，189 個基因在過表達組特異表達，223 個基因在對照組特異表達。

應用DEseq軟件共鑒定到 30 個差異基因，全部為下調基因(圖2，表1)。Gene Ontology功能聚類分析發現，免疫反應與能量代謝類基因顯著富集(圖3)，暗示此階段過表達 miR-127-3p 可能會影響成肌分化進程。此外，鑒定得到 20 個顯著富集的經典KEGG信號通路(圖4)，其大部分信號通路的功能主要與病毒感染與免疫疾病相關。但信號通路Viral myocarditis、Cell adhesion molecules(CAMs)值得關注，這些差異基因同樣是成肌分化過程中的重要功能基因。

圖中紅色點表示有顯著性差異表達的上調基因，綠色點表示有顯著性差異表達的下調基因, 藍色為差異基因篩選閾值padj<0.05以下的基因 Red dot indicates the differential gene was expressed increasingly, whereas blue one refers to the down-regulated differential gene in OE group, compared with that in the NC group. The significance of threshold is padj<0.05

圖2不同處理組細胞的差異基因火山圖
Fig.2VolcanoplotofdifferentialgenesidentifiedbetweenOEandNCgroup

2.3 miR-127-3p靶基因預測

為了進一步鑒定受miR-127-3p調控的轉錄因子，將差異表達基因(表1)與TFCat數據庫進行匹配，結果發現2個轉錄因子，即Irf7和Ddit3。這暗示轉錄因子Irf7和Ddit3表達的變化可引起下游多個受其調控的靶基因表達變化，進而導致處理組與對照組的細胞表型變化。為了進一步確定miRNA與潛在的靶基因之間是否存在直接堿基配對關系，對miR-127-3p與Ddit3基因序列進行比對分析，發現 miR-127-3p 與Ddit3基因的蛋白編碼區(CDS)存在堿基互補配對關系(圖5)，暗示miR-127-3p可能通過堿基配對的方式影響Ddit3基因的表達。同時，該結果有助于完善miR-127-3p的成肌分化調控軸(圖6)，miR-127-3p與Ddit3基因的關系還需進一步試驗驗證。

表1 miR-127-3p過表達與對照組細胞間的差異表達基因Table 1 Deferentially expressed genes between miR-127-3p overexpression and negative control group

圖3 不同處理組間的差異基因GO富集分析Fig.3 Enrichment analysis of differential genes between OE and NC group

圓圈的顏色表示每個信號通路相應的顯著性P值，圓圈大小則表示每個信號通路上出現的差異基因個數 Circle color indicates the significance of enriched KEGG pathway, while circle size refers to count of gene in the pathway

圖4不同處理組間的差異基因KEGG信號通路富集分析
Fig.4KEGGenrichmentofdifferentialgenesbetweenOEandNCgroup

紅色部分為本文研究結果，黑色部分為Alter等[36]已有研究 The red parts indicate findings in present study, and the black parts refer to the known findings of Alteretal[36]

圖5miR-127-3p成熟序列與轉錄因子Ddit3基因編碼區(CDS)序列比對
Fig.5AlignmentofmiR-127-3pwiththecodingsequence(CDS)ofDdit3inmouse

圖6 miR-127-3p的成肌分化調控軸Fig.6 Sketch of miR-127-3p regulating myogenic differentiation

3 討 論

骨骼肌的生長發育主要表現為肌細胞數量的增加和體積的增大，這兩方面的順利進行依賴于成肌細胞的增殖和分化[29]。MiRNAs在轉錄后水平調控基因表達，在肌細胞的增殖和分化過程中發揮重要作用[30]。miR-1/miR-206/miR-133僅在肌肉組織中特異表達，而miR-127在動物的多個組織廣泛表達，且在肌肉、皮膚和脾臟中表達較高[23-24]。筆者近期研究發現 miR-127-3p 表達量隨 C2C12 肌細胞分化逐漸增高[24]，暗示 miR-127-3p 參與骨骼肌細胞分化的調控。此外，研究還發現 miR-127 能夠抑制小鼠肝臟癌細胞的增殖[31]，且其在胎兒肺發育過程中發揮重要調控作用[32]。以上研究說明，miR-127 在動物早期發育及器官形成方面有重要調控作用。本研究結果表明，過表達 miR-127-3p 導致 C2C12 細胞 30 個蛋白編碼基因顯著下調，這些基因主要富集于免疫反應和能量代謝相關的生物學過程與信號通路(圖3，圖4)，說明 miR-127-3p 通過改變免疫反應和能量代謝相關的生物學過程來影響 C2C12 細胞的成肌分化。Karpati 等[33]和Honda等[34]早期研究表明，包括主要組織相容性復合體Ⅰ(MHCⅠ)等在內的大量與免疫相關的基因在成肌分化過程中發揮重要作用，這些免疫類分子可能參與肌細胞融合為多核肌管階段的肌細胞間識別與互作過程。此外，O’Connor等[35]研究發現成肌細胞融合是一個高耗能(ATP)的生物學事件，小鼠初級成肌細胞培養物中補充磷酸肌醇可增加細胞能量的供給，進而促進肌管生成，這種促成肌效應是通過肌酸激酶依賴的途徑發揮作用。以上分析表明，miR-127-3p 可能通過調節免疫類與能量代謝類基因的表達來調控肌細胞識別、融合及能量供給環節，進而影響肌管生成。

Ddit3(DNA-damage inducible transcript 3)為一個重要的轉錄因子，參與多個生物學過程的調控。Alter等[36]研究發現Ddit3可直接抑制MyoD基因轉錄進而負調控成肌細胞分化。本研究發現，miR-127-3p可能直接靶向轉錄因子Ddit3基因CDS區域(圖5)以調控其表達，并顯著促進C2C12細胞的成肌分化(圖1)，這與前期對Ddit3成肌功能的研究結果一致。此外，侯金星等[37]認為chi-miR-4110 對奶山羊Smad2基因有靶向調控作用。穆松等[38]確定出miRNA上的功能性SNP位點對miRNA的靶基因選擇和結構穩定有很大影響，并最終通過miRNA來影響動物表型的改變。因此，該結果有助于完善miR-127-3p的成肌分化調控軸(圖6)，但miR-127-3p與Ddit3基因的調控關系還需要進一步試驗驗證。盡管miRNA靶向mRNA的蛋白編碼區(CDS)為miRNA的非主流調控方式，近年來也相繼出現不少研究報道，如 miR-148與DNMT3b[39]、miR-183與betaTrCP1[40]、miR-143與PTN[41]、 miR-375與 CIP2A[42]、miR-20a與PRKG1[43]、miR-128與MSTN[44]、miR-15/107與BRCA1[45]、miR-932與DNLG2[46]、MiR-193a-5p 與AP-2alpha[47]、miR-342-5p/miR-10aCVB3[48-49]、Cgi-miR-92d與CgLITAF3[50]。這些研究充分說明miRNA與其靶基因的CDS區形成堿基互補配對，也是 miRNA 發揮轉錄后調控的一種重要方式。本研究有助于闡明 miR-127-3p 調節肌肉發育分化的分子機理，同時，也為人的肌類疾病的靶向治療提供理論依據。但還需進一步通過熒光素酶報告載體鑒定 miR-127-3p 的靶基因及其對細胞成肌分化的影響效應。

4 結 論

過表達 miR-127-3p 顯著促進C2C12細胞的成肌分化；在轉錄組水平上，miR-127-3p可能通過調控免疫與能量代謝類基因的表達來調節成肌細胞的分化；miR-127-3p可能直接靶向Ddit3基因CDS區域以調控其表達。