超聲波輔助殼聚糖固定化復合酶澄清枸杞汁的響應面優化

頡向紅，劉 軍，徐 昊，張喜康，馬浩然，孔維洲，劉敦華

(寧夏大學 農學院，銀川 750021)

枸杞(Lyciumbarbarum)又名枸杞子或枸杞的果實，是茄科落葉灌木，廣泛分布于中國西北部，歐洲東南部和地中海地區的干旱和半干旱地區[1]。枸杞是世界上著名的中藥材和保健食品，具有幫助滋養肝腎，提神明目等功能[1-2]。枸杞中主要的化學成分如枸杞糖類、色素、氨基酸、黃酮及堿類等有大量的藥理作用[3-4]。黑枸杞 (LyciumruthenicumMurr)又名黑果枸杞，樹屬多棘刺灌木，大都分布在高山沙地，含有豐富的紫花色苷素及豐富的游離氨基酸、維生素、少量的微量元素，營養物質非常高，它具有可以延緩人體細胞組織的老化、護肝明目、抗疲勞、改善睡眠等作用[5]。

由于枸杞汁中存在易引起果汁混濁甚至導致沉淀的果膠以及蛋白質等大分子物質，這使得枸杞汁在加工生產、儲存過程中出現混濁的主要原因之一[6]。為了克服以上難題，普遍應用以可溶形式存在果汁工業領域中的果膠酶，纖維素酶的商品酶制劑，因為它們促進這些化合物的水解，改善過濾，澄清，最終使產品穩定化[7-10]。但使用游離酶制劑存在較難回收和資源較高等問題，隨著酶工程的逐步成長，固定化酶在一定水平上填補了這一缺陷[11]。以殼聚糖為載體制得的固定化酶，穩定性較高，機械機能較好且容易回收[12]，而殼聚糖作為自然陽離子澄清劑，含有較好的絮凝作用，使其絮凝是由于它可以和果漿中帶負電荷物質如蛋白質、果膠、纖維素互相作用[13-14]，因此采取超聲波輔助殼聚糖固定化酶法來澄清枸杞汁。超聲波有助于澄清是因為超聲波的強烈振動和空化效應能使有用因素急速溶入溶劑[15-16]，并且超聲波具有促進酶解和用時短等優點[17]。本試驗以枸杞汁的透光率為指標，采取超聲波輔助殼聚糖固定化復合酶澄清枸杞汁，通過響應面優化澄清酶解工藝，為果汁澄清的綜合開拓利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞、黑枸杞，購自銀川新百超市；殼聚糖(脫乙酰度≥90%)，購自青島云宙食品添加有限公司；果膠，購自廣州萬邦有限公司；羧甲基纖維素鈉鹽，購自常熟威怡科技有限公司；果膠酶、纖維素酶(酶活力10 U/g)，購自河南萬邦實業有限公司；冰乙酸，購自鄭州市高研生物科技有限公司；沒食子酸，購自天津市大茂化學試劑廠；蒽酮，購自上海光諾化學科技；乙醇、苯酚、亞硫酸鈉、無水碳酸鈉、乙酸、乙酸鈉、考馬斯亮藍G-250 均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

數控超聲波洗濯器(昆山市超聲儀器有限公司)；6新世紀紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；TDL-5-A型低速臺式大容量離心機(上海安亭科學儀器廠)；SHZ-D循環水真空泵(鄭州長城科貿)；SRT-AI80多功能食品加工器 (青島貿潤電器制造有限公司)；數顯恒溫水浴器(上海博迅實業有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程 工藝流程：原料選擇(黑紅枸杞)→預處理(清洗干枸杞并用溫水浸泡0.5 h)→打漿(料水質量比1∶6)→粗濾(兩層紗布過濾)→超聲波澄清→枸杞汁

1.2.2 殼聚糖固定化復合酶的制備 參考文獻[18-19]的方法，依據本試驗要求進行微調整：1 g殼聚糖溶解于φ=1%冰醋酸并定容至100 mL，震蕩攪拌均勻，使完全溶解，將上述溶液用5 mL 的注射器逐滴加入到 100 mL 混合液(φ=10% NaOH與φ=95%乙醇，體積比為 4∶1)中，在 4 ℃ 冰箱中過夜，滴入少許φ=5%戊二醛，攪拌后再靜置幾個小時，抽濾并用水沖至偏中性，在抽干后交聯的殼聚糖-戊二醛載體上加入纖維素酶和果膠酶的酶液，振蕩均勻后，4 ℃固定幾個小時，用蒸餾水洗去未固定的酶，再抽干即得固定化復合酶。游離酶經殼聚糖固定化后，固定化果膠酶活性為62 356 U/g[20]，固定化纖維素酶活性為99 450 U/g[21]。

1.2.3 枸杞汁透光率最佳波長的確定 量取少量已加入固定化復合酶20 g/L[m(纖維素酶)∶m(果膠酶)=1∶2]于50 ℃下超聲反應60 min后的復合枸杞汁中，在不同波長下采取分光光度法測定枸杞汁的吸光度，用最佳波長處的透光率(T，%)來表現枸杞汁的澄清度。

1.3 單因素試驗

1.3.1 復合酶比例篩選 量取10 mL復合枸杞汁，加入不同質量比的殼聚糖固定化果膠酶和殼聚糖固定化纖維素酶(1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1)復合酶液20 g/L，在50 ℃下超聲反應60 min，在最佳波長處測其透光率。

1.3.2 殼聚糖固定化復合酶的添加量 量取10 mL復合枸杞汁，加入m(纖維素酶)∶m(果膠酶)=1∶2的復合酶，用量分別為10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L和50 g/L，在50 ℃下超聲反應60 min，確定酶不同添加量對枸杞汁透光率的影響。

1.3.3 超聲時間 量取10 mL復合枸杞汁，酶添加量為20 g/L[m(纖維素酶)∶m(果膠酶)=1∶2] 時，在50 ℃下分別超聲反應30 min、60 min、90 min、120 min和150 min，確定超聲時間的差異對枸杞汁透光率的影響。

1.3.4 超聲溫度 量取10 mL復合枸杞汁，酶添加量為20 g/L[m(纖維素酶)∶m(果膠酶)=1∶2]時，分別在45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃和65 ℃下超聲反應60 min，確定超聲溫度的差異對枸杞汁透光率的影響。

1.4 澄清工藝的響應面試驗優化

以單因素試驗結果為依據，酶添加量(g/L)、超聲時間(min)、超聲溫度(℃)為自變量，枸杞汁透光率為響應值，采取Box-Behnken來設計試驗，通過三因素三水平的響應面分析法對枸杞汁澄清工藝進行優化，試驗設計見表1。

1.5 澄清前后營養成分的對比

采用考馬斯亮藍法[22]測定水溶性蛋白質；采用手持糖度計法糖度；采用DNS法[23]測定還原糖；采用蒽酮-硫酸法[24]測定多糖；采用福林酚比色法[25]測定總酚；采用分光光度計法[26]測定類胡蘿卜素。

2 結果與分析

2.1 枸杞汁透光率最佳波長的確定

由圖1可以看出，當所測定的波長到達700 nm 時，枸杞汁透光率可以到達78.79%，700 nm 以后透光率基本穩定不變，所以確定枸杞汁透光率最佳波長為700 nm。

2.2 殼聚糖固定化果膠酶和纖維素酶比例的確定

從圖2可以看出，當m(纖維素酶)：m(果膠酶)是1∶2時，透光率最佳。當其質量比為3∶1和2∶1時，透光率減小。這可能由于纖維素酶活即酶解能力會因纖維素酶質量濃度的增長而削弱，導致透光率降低[17]。所以選擇m(纖維素酶)∶m(果膠酶)的比例為1∶2。

表1 Box-Benhnken試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

圖1 果汁透光率與所測定波長的關系曲線Fig.1 Relationship between wolfberry juice transmittance and wavelength

圖2 固定化復合酶比例酶解效果的比較Fig.2 Comparison of enzymatic hydrolysis effects of immobilized complex enzymes

2.3 單因素試驗

2.3.1 酶添加量的差異對枸杞汁透光率的影響 由圖3可以看出，透光率會因酶添加量的增多而呈現出先增加后減小的趨勢(P<0.05)。當酶添加量為20 g/L時，透光率最大為79.93%，故綜合考慮選用10～30 g/L為響應面的優化條件。

2.3.2 超聲時間的差異對枸杞汁透光率的影響 由圖4可以看出，在30～150 min的5個超聲時間階段內，隨著超聲時間的延伸，枸杞汁的透光率逐漸上升。60 min和120 min時兩者的透光率之間相差不大并且差異性不顯著(P>0.05)，當超聲時間超過120 min時，枸杞汁透光率下降，可能是隨著超聲時間的延長，大量的多糖分化成單糖[17]。考慮時間效率的問題，選用30～90 min為響應面的優化條件。

2.3.3 超聲溫度的差異對枸杞汁透光率的影響 由圖 5 可以看出，枸杞汁的透光率會隨超聲溫度的增加而呈現先增加后減小的趨勢，并且55 ℃和60 ℃時兩者之間的透光率差異不顯著(P>0.05)。透光率減少可能是由于復合酶活性會隨著超聲溫度的增加而減弱或者失活[17]，所以選用45 ℃～55 ℃為響應面的優化條件。

不同字母表示差異顯著(P<0.05) Different letters indicate significat difference (P<0.05)；相同字母表示差異不顯著(P>0.05) The same letter indicates no significant difference(P>0.05);下同 The same below

圖3不同酶添加量下枸杞汁的透光率
Fig.3LighttransmittanceofLyciumbabarumjuiceunderdifferentenzymedosage

圖4 不同超聲時間下枸杞汁的透光率Fig.4 Light transmittance of Lycium barbarum juice under different ultrasonic time

圖5 不同超聲溫度下枸杞汁的透光率Fig.5 Light transmittance of Lycium barbarum juice under different ultrasonic temperature

2.4 響應面試驗優化

Box-Behnken試驗設計及結果見表2。

2.5 回歸分析

對表2中數據進行方差分析和多元回歸分析，獲得透光率對A(酶添加量 g/L)、B(超聲溫度 ℃)、C(超聲時間min)的二次多項回歸模型：Y=82.20+1.67A+0.26B+0.58C+0.26AB-0.12AC+0.29BC-2.09A2-2.00B2-1.83C2

2.6 交互作用分析

由圖6中的響應曲圖可以看出，超聲溫度一定時，響應值透光率隨著酶添加量的增多而不斷增大，這可能是因為能夠引起枸杞汁混濁的果膠物質和多糖組織分解能力會隨著酶添加量的增多而增強，使得枸杞汁變成澄清透亮，透光率不斷提高；酶添加量一定時，透光率隨著超聲溫度的增加先增加后減少，變化程度較少，超聲溫度與酶的活性代謝息息相關，只有在最適的溫度范圍內，酶的活性才能發揮到最佳，超聲溫度超過最適溫度范圍都會影響酶的活性，即枸杞汁透光率隨酶的活性能力發生改變，呈先增大后減少的變化趨勢。由圖7中響應曲圖可以看出，超聲時間一定時，透光率隨酶添加量的增加呈上升趨勢，但上升幅度較小；酶添加量一定時，透光率隨超聲時間的增加呈上升的變化趨勢，變化幅度也較小。由圖8可以看出，超聲時間一定時，透光率隨超聲溫度的增加先增加后減少，透光率減少可能是由于酶活性會因超聲溫度的升高而降低，枸杞汁的透光率也隨著降低，變化較大；超聲溫度一定時，透光率會因超聲時間的增加先增加后減少，變化幅度也較大。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

注：“*”代表差異顯著(P<0.05)；“**”代表差異極顯著(P<0.01)。

Note:“*” indicates significant(P<0.05);“**” indicates extremely significant(P<0.01).

試驗中每兩個因素之間的交互程度對響應值的影響大小，可以通過等高線圖直觀看出，圖6和圖8中的等高線圖都呈現卵形，卵形表示兩者之間交互顯著[27]。故A、B項和B、C項交互作用顯著(P<0.05)；圖7的等高線圖趨于圓形，圓形表示交互作用不顯著[27]，故A、C項之間的交互作用不顯著(P>0.05)，該結論與方差分析結論相同，均表明交互項中僅有A、C項交互作用不顯著。

圖6 透光率與酶添加量和超聲溫度的響應面和等高線Fig.6 Response surface and contour of light transmittance and enzyme addition amont and ultrasonic temperature

圖7 透光率與酶添加量和超聲時間的響應面和等高線Fig.7 Response surface and contour of light transmittance and enzyme addition amont and ultrasonic time

2.7 最優澄清工藝優化及驗證

經Design Expert 8.0.6軟件分析優化出的最優澄清工藝參數為：超聲溫度50.51 ℃，超聲時間64.61 min，殼聚糖固定化復合酶用量24.03 g/L，在此優化條件下透光率為84.60%，為了適合生產實際，便利操作，將各工藝參數調整為：超聲溫度50 ℃，超聲時間65 min，殼聚糖固定化復合酶用量24 g/L，3次重復驗證試驗，測得枸杞汁平均的透光率值為84.51%，與預測值的誤差僅為0.107，說明該模型與實際情況擬合度較高，因此在實際操作中可用此模型優化出的工藝參數進行生產。

2.8 營養成分分析

理化指標標準曲線的回歸方程和相關系數見表4。

表4 理化指標標準曲線的回歸方程和相關系數Table 4 The regression equation and correlation coefficient of the standard curve of physical and chemical indicators

注：y代表吸光度值，x代表各理化指標的值。

Note:yrepresents the absorbance value, andxrepresents each physical and chemical index.

由表5可以看出，枸杞汁澄清前后，殼聚糖固定化復合酶澄清枸杞汁對其主要營養物質的影響各有差異，導致果汁混濁的總酚、水溶性蛋白質的下降率分別為11.92%和13.86%，可能是因為多數水溶性蛋白質和少數酚類物質會隨著殼聚糖的絮凝性能[11]和果膠酶以及纖維素酶的分化功能而沉降[4]，使其含量下降；枸杞汁中主要的營養活性物質多糖、還原糖、類胡蘿卜素的損失率為10.77%、4.10%、10.53%，說明在響應面法優化前提下，殼聚糖固定化復合酶澄清能良好地保存枸杞汁中的主要營養物質。

表5 酶解前后枸杞汁營養成分的對比Table 5 Comparison of nutritional composition of Lycium barbarum juice before and after enzymatic

3 結 論