二穗短柄草DREB1G基因表達模式分析和 在擬南芥中的異源過量表達

Eltayeb Mohamed Eltayeb Elhassan，牛 欣，蘇亞麗，陳守坤，李海峰

(旱區作物逆境生物學國家重點實驗室,西北農林科技大學 農學院,陜西楊凌 712100)

植物在生長發育過程中可能會受到高溫、低溫、干旱、高鹽等不同環境脅迫。轉錄因子通過調控下游靶基因的表達，影響一系列生理生化反應，在非生物脅迫的應答過程中發揮關鍵作用[1]。植物特有的轉錄因子DREB(Dehydration responsive element binding protein)保守的AP2結構域與DRE/CRT順式作用元件特異性結合，誘導下游基因的表達，提高植物對非生物脅迫的耐受性[2-6]。

DREB基因在高等植物中廣泛存在，目前已從擬南芥[6-7]、水稻[8]、小麥[9]、大麥[10]等物種中分離得到了DREB基因。越來越多的證據顯示，DREB基因在植物抗逆過程中發揮重要功能。在擬南芥中過量表達擬南芥DREB1/CBF基因，提高了轉基因植株對低溫、干旱和氧脅迫的耐受性[11]； 在擬南芥中過表達OsDREB1A，轉基因植株對高鹽和低溫脅迫的抵抗力增強[8]。過表達GmDREB1的轉基因小麥對鹽脅迫表現出更高的耐受性，幼苗期根長、鮮質量和分蘗數與野生型相比更高[12]。

二穗短柄草具有生命周期較短，植株較小，易種植，基因組較小，自花授粉和轉化效率高等特點，成為新型的禾本科模式植物[13-15]。二穗短柄草有很多CBF家族基因[16-17]，但有關BdDREB的功能研究還很少。本研究以二穗短柄草Bd21為材料，克隆得到BdDREB1G基因，分析不同物種中的同源蛋白質序列和進化關系和基因的表達模式，構建過表達載體，轉化得到了擬南芥，為該基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗中所用植株為二穗短柄草Bd21。將二穗短柄草種子置于人工氣候箱中催芽萌發(26 ℃，16 h光照/8 h黑暗)。在培養皿上培養1周后，移栽至營養土中。4 ℃春化2周后，轉入西北農林科技大學旱區作物逆境生物學國家重點實驗室人工氣候室(26 ℃，16 h光照/22 ℃，8 h黑暗)。

1.2 方 法

1.2.1 序列分析及引物設計 從Gramene網站[18]上BLASTP檢索同源蛋白，用DNAMAN軟件進行多重序列比對，用MEGA 6.0軟件NJ法構建系統發育樹。使用Primer Premier 5.0軟件設計引物，如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.2 表達模式分析 對2周大的幼苗進行質量分數為20% PEG6000(模擬干旱)、200 mmol/L的NaCl(模擬高鹽)、100 μmol/L的ABA、20 μmol/L的6-BA、1 mmol/L的SA和100 μmol/L的MeJA(模擬激素脅迫)、45 ℃、4 ℃處理2 h，分別采集取幼苗根或者葉片，同時采集抽穗期植株的根、莖、葉片和花，提取總RNA。RNA提取參考Trizol(TAKARA)說明書。使用羅氏反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA第一鏈。qRT-PCR使用SYBR Premix ExTaq(TAKARA)試劑盒，按照說明書操作。反應體系、擴增條件及數據分析參考竇艷華等[19]研究。

1.2.3 過表達載體構建 KOD高保真酶(TOYOBO)進行PCR擴增目的片段。用NcoⅠ和PmacⅠ將pCAMBIA1301過表達載體雙酶切，將線性化載體與目的片段用重組酶(Vazyme)進行連接，轉入大腸桿菌E.coli中。具體參考一步克隆法說明書。通過菌落PCR及雙酶切進行鑒定，并經測序(上海生工)確認后，選擇陽性克隆提取質粒，經凍融法轉入農桿菌GV3101感受態細胞，菌落PCR鑒定陽性克隆。

1.2.4 擬南芥轉化及轉基因植株篩選、鑒定和表型觀察 用蘸花法侵染擬南芥，收獲種子后曬干。用體積分數為70%乙醇及質量分數10%次氯酸鈉對種子進行消毒后4 ℃處理3 d，播種于含40 mg/L潮霉素的1/2MS培養基上。黑暗培養3 d后，在光照16 h/黑暗8 h條件下培養2周。待幼苗長至4～6 葉期時移至土壤中，繼續光照16 h/黑暗8 h培養，觀察表型。

2 結果與分析

2.1 序列分析

NCBI上BLASTP結果顯示，BdDREB1G含有一個保守DREB結構域，屬于DREB轉錄因子家族(圖1)。與黑麥CbfI-1(SecalecerealecultivarLo7 CbfI-1，KY780081.1)、小麥CBFI(TriticumaestivumAP2 domain CBF protein，CBFI，JN987191.1)、大麥CBF1(Hordeumvulgaresubsp.SpontaneumCBF1，JF796655.1)和粗山羊草DREB1G(Aegilopstauschiisubsp.TauschiiDREB1G，XM_020337958.1)的一致性分別為81%、81%、79%和79%。編碼區不存在內含子，序列長度684 pb，編碼227個氨基酸。預測其分子質量為24.18 ku，等電點為5.87，負電荷殘基總數28，正電荷殘基總數24，親水性平均系數為-0.486，提示該蛋白質可能為親水性蛋白質。

圖1 BdDREB1G保守結構域Fig.1 Conserved domain of BdDREB1G

將BdDREB1G的CDS序列在NCBI中進行BLASTN比對發現，其與小麥、燕麥、黑麥、大麥等禾本科植物中的DREB轉錄因子序列具有較高的同源性。將擬南芥(AtCBF1，NP_567721.1；AtCBF2，ABV27118.1；AtCBF3，ABV27138.1；AtCBF4，NP_200012.1)、水稻(OryzasativaJaponica DREB1G，XP_015624757.1)、二穗短柄草(CBF1，AFD96407.1；CBF2，AFD96408.1；CBF3，AFD96409.1；CBF4，AFD96410.1；CBF5，AFD96411.1；CBF6，AFD96412.1)、粗山羊草DREB1G、玉米(ZeamaysDREB1A，NM_001157386.2)、小麥CBFI、一粒小麥(TriticummonococcumCBF15，EU076383.1)、大麥CBF1、燕麥(AvenasativaCBF1，AM071406.1；CBF2，AM071407.1)、黑麥CbfI-1、高粱(SorghumbicolorDREB1G，XM_002454439.2)、慈竹(NeosinocalamusaffinisDREB1，JN896707.1)、谷子(SetariaitalicDREB1G，XM_004953380.4)中的DREB同源蛋白質序列與BdDREB1G進行系統發育樹分析，圖2結果顯示，BdDREB1G與AetDREB1G，TaCBF1，HvCBF1和ScCbfI-1在同一個分支上，它們都屬于早熟禾亞科且具有較近的親緣關系的結論一致；與擬南芥的CBF1、CBF2、CBF3和CBF4聚類于A-1亞組中，提示BdDREB1G可能具有A-1亞組蛋白質功能。

DREB蛋白質多重序列比對結果顯示(圖3)，在BdDREB1G含有N-末端一段保守的AP2結構域，2個CBF特征基序(PKKR/PAGR和DSAWR基序)和一個C-末端的酸性結構域，且在PKKR/PAGR基序的第7位精氨酸(R)和第10位的苯丙氨酸(F)，及AP2結構域的第14位纈氨酸(V)和谷氨酸(E)高度保守。

圖2 DREB蛋白質系統發育樹Fig.2 Phylogenic tree of DREB proteins

2.2 非生物脅迫處理及不同組織中的表達模式分析

由圖4可知，根據實時定量PCR的結果，BdDREB1G在抽穗期的二穗短柄草不同組織中表達不同，其中莖中表達量最高，其次是葉片和根，在花序中表達量最低。不同非生物脅迫處理后其表達水平也有差異。其中，水楊酸處理強烈誘導其表達，高溫和低溫處理后表達量也顯著上升。干旱脅迫、ABA、6-BA及MeJA處理則對該基因的表達無顯著影響。提示BdDREB1G可能參與溫度脅迫應答及SA信號轉導途徑，與擬南芥中的同源蛋白質CBFs可能具有相似的功能。

2.3 過表達載體構建

為了初步研究BdDREB1G基因的功能，構建過表達載體。首先運用RT-PCR擴增到了目的片段(圖5-A)，電泳圖中目的條帶大小與預期一致；切膠回收后與過表達載體pCAMBIA1301進行重組反應，然后轉化到大腸桿菌中。菌落PCR結果表明得到了陽性克隆(圖5-B)。選取陽性克隆提取質粒，進行NcoⅠ 單酶切驗證，電泳結果顯示，除質粒帶以外，在250 bp與500 bp之間出現一條帶，與基因內366 bp處含有一個NcoⅠ 的酶切位點一致(圖5-C)，表明已經成功構建了BdDREB1G的過表達載體。

圖4 BdDREB1G在不同非生物脅迫下及不同部位中表達水平Fig.4 Expression levels of BdDREB1G under different abiotic stresses and in different tissues

A.RT-PCR擴增BdDREB1GAmplification ofBdDREB1Gvia RT-PCR； B.菌落PCR結果 Results of Colony PCR；1～6.6個單克隆 Different clones；7.陽性對照 Positive control；8.陰性對照 Negative control；C.單酶切驗證NcoⅠ single restriction digestion of recombined plasmid;M.marker 2000

圖5表達載體構建
Fig.5Constructionofoverexpressionvectors

2.4 轉基因擬南芥鑒定和表型觀察

提取擬南芥葉片總DNA，經過PCR鑒定，可以檢測到特異條帶，確定為過表達轉基因植株(圖6)。經過篩選鑒定，共獲得11株轉基因擬南芥植株。經表型分析，其中OE-BdDREB1G-4和OE-BdDREB1G-72個株系的表型最強，與野生型植株相比，均表現出生長遲緩、植株矮小和晚花的表型(圖7)。轉基因植株的抗逆性能有待于進一步分析。

M.DNA marker 2000;1,4,7.代表3個不同編號株系的DNA驗證結果 The results of DNA verification of three differenet strains;PC.陽性對照 Positive control;NC.陰性對照 Negative control

圖6轉基因擬南芥PCR鑒定
Fig.6PCRidentificationoftransgenicArabidopsis

3 討 論

AP2/DREB家族成員都含有一段長約60個氨基酸的保守AP2結構域，可以與DNA結合，尤其是第14位的纈氨酸(V14)和第19位的谷氨酸(E19)可能影響CBF/DREB對CRT元件的結合活性。而CBF1轉錄因子的N-末端AP2結構域的上游都含有一段堿性氨基酸序列PKKR/PAGRXKFXETRH模體，具有核定位功能，可能與蛋白質運輸相關[20-21]；C-末端含有一段酸性活化區域DSWAR模體[22]。本研究分析了二穗短柄草DREB1G的氨基酸序列，發現該蛋白質含有一段63個氨基酸組成的高度保守的AP2結構域，N-末端有核定位信號肽PKRRAGRTKFKETRHP，C-末端含DSPR，而在這些結構域外的氨基酸序列沒有顯著同源性，這與前人研究一致[23-24]。不同位置氨基酸序列的保守性及多樣性可能與其功能相關。

進化分析顯示，BdDREB1G與粗山羊草、小麥、大麥和黑麥中的CBF/DREB蛋白質處于同一分支上，提示這些蛋白質可能具有相同的祖先來源，與這幾種植物都屬于早熟禾亞科且具有較近的親緣關系的結論相符。BdDREB1G與擬南芥CBF1/2/3/4在同一分支上，提示可能與之具有相似的功能。

擬南芥CBF1/2/3基因受到低溫誘導表達[6]，CBF4基因受到干旱誘導表達[7]。與此相似，在本研究中，BdDREB1G受到干旱誘導后表達量顯著下降，在高溫、低溫脅迫后表達量顯著上升，提示BdDREB1G可能在植物響應干旱、低溫和高溫過程中起重要作用。

圖7 轉基因擬南芥的表型Fig.7 Phenotypes of transgenic Arabidopsis lines

CBF/DREB是非生物脅迫應答過程中一類關鍵的轉錄因子，可以調控下游基因的表達改變植株的抗逆性，為通過轉基因技術改良植物抗逆性提供更多選擇[25]。過量表達DREB1/CBF基因的植株在改變抗逆性的同時，植株的生長也可能受到抑制。過表達AtDREB1A和OsDREB1A的轉基因擬南芥的抗低溫和抗旱性增強，但在正常生長條件下，生長嚴重受阻[8,26]。將OsDREB2A在擬南芥中過量表達，植株生長受到抑制，顯著矮化[26]。與此相似，在本研究中，過量表達BdDREB1G的轉基因擬南芥也表現出嚴重矮化、生長遲緩、晚花的表型。可能是因為DREB1B/CBF通過影響GA代謝失活，鈍化酶降低了GA的活性，從而使轉基因植株生長遲緩[27-28]。而在過表達一個受DREB1A調控基因的轉基因擬南芥中，多個參與光合作用和碳水化合物代謝的基因的表達受到抑制，這也可能引起轉基因擬南芥的生長抑制[29]。

4 結 論

本研究克隆了二穗短柄草中的DREB1G基因，編碼一個含227個氨基酸的蛋白質，含有一個典型的AP2保守結構域，屬于CBF轉錄因子亞家族。BdDREB1G基因受到高溫、低溫或SA脅迫后表達量與對照相比顯著上調。將其在擬南芥過量表達，通過潮霉素篩選獲得轉基因植株，與野生型擬南芥相比，轉基因植株明顯表現出生長遲緩、植株矮小且晚花，提示BdDREB1G可能參與植物生長發育和開花的調控。