紅芽芋超低溫療法脫毒苗基因組DNA 甲基化的MSAP分析

尹明華，廖 玉，萬(wàn)志庭

(上饒師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，江西上饒 334001)

表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)是指在DNA序列沒(méi)有發(fā)生變異的情況下基因表達(dá)的可遺傳改變，且可隨細(xì)胞有絲分裂和(或)減數(shù)分裂遺傳給后代[1]。DNA 甲基化是一種表觀遺傳現(xiàn)象，即在 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，以 S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到 DNA分子中特定堿基上的過(guò)程，主要形成5-甲基胞嘧啶[2]。DNA甲基化通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA 構(gòu)象、DNA 穩(wěn)定性及DNA 與蛋白質(zhì)相互作用方式，關(guān)閉某些基因的活性從而控制基因表達(dá)[3]。DNA甲基化參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和組織分化[4]。DNA甲基化作為細(xì)胞記憶的一種機(jī)制，是表觀遺傳學(xué)研究的“主角”[5]。

紅芽芋(ClocasiaescalentaSchott)，單子葉植物，屬天南星科，為多年生宿根性草本植物。江西鉛山素有種植紅芽芋的傳統(tǒng)，種植歷史悠久，藥食兼優(yōu)。食用，肉質(zhì)松，品質(zhì)鮮美、細(xì)膩，粉而不粘，口感好；藥用，增強(qiáng)人體的免疫功能，潤(rùn)腸通便，防止便秘[6]。長(zhǎng)期以來(lái)，紅芽芋多采用無(wú)性繁殖方法，不僅繁殖系數(shù)低，而且易積累病毒，如芋花葉病毒、黃瓜花葉病毒和芋羽狀斑駁病毒等，導(dǎo)致種性退化，品質(zhì)變差，產(chǎn)量下降[7]。超低溫療法(Cryotherapy)是近年發(fā)展起來(lái)的基于超低溫保存(Cryopreservation)的一種新型高效的脫毒技術(shù)，相比傳統(tǒng)脫毒法具有脫毒率高和脫毒率不依賴莖尖大小等兩個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)[8]。現(xiàn)有研究表明，超低溫保存實(shí)質(zhì)是一種逆境脅迫的過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中，存在多種滲透脅迫，如PEG、甘露醇等，均能引發(fā)基因組 DNA 特異區(qū)段的甲基化[9]。但病毒是一種生物脅迫，用超低溫保存的技術(shù)脫除病毒實(shí)際上是一種解除生物脅迫的過(guò)程。

有研究[10]表明，植物感染病毒導(dǎo)致的甲基化整體水平上升有利于病毒攻擊時(shí)植物基因組的穩(wěn)定。但超低溫療法脫毒后，再生脫毒苗的基因組DNA甲基化有何變化，尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。檢測(cè)DNA甲基化的方法主要有色譜法、酶切法、測(cè)序法、甲基化PCR檢測(cè)法、芯片法等多種方法，MSAP(Methylation sensitive amplification polymorphism，甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性)技術(shù)是一種以甲基化修飾敏感性不同限制性內(nèi)切酶和PCR為基礎(chǔ)的新技術(shù)，靈敏度高，不受被測(cè)DNA序列信息限制，檢測(cè)位點(diǎn)多，成本低，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性高，已成為檢測(cè)植物基因組DNA甲基化水平和模式的重要方法[11]。本試驗(yàn)以紅芽芋超低溫療法脫毒苗為研究對(duì)象，使用MSAP方法并結(jié)合毛細(xì)管自動(dòng)電泳儀對(duì)其基因組DNA甲基化水平和甲基化模式進(jìn)行分析，為超低溫療法脫毒的表觀遺傳研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

江西鉛山紅芽芋帶毒苗(對(duì)照組，編號(hào)為1～10)；江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗(處理組，編號(hào)為11～30)。以上30份材料均由上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院植物組織培養(yǎng)室提供。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取 采取改良的CTAB法進(jìn)行DNA提取，每個(gè)樣本采取0.5 g葉片進(jìn)行DNA提取。

采取改良的CTAB法進(jìn)行DNA提取，每個(gè)樣本采取0.5 g葉片進(jìn)行DNA提取。步驟如下：

①在65 ℃水浴鍋中預(yù)熱CTAB提取液。

②在液氮中迅速研磨樣品，將粉末狀材料轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加入預(yù)熱的CTAB提取液(每克樣品加入3～5 mL的提取液)，65 ℃保溫30～60 min，每隔10 min輕輕顛倒混勻。

③11 000 r/min，離心5 min，取上清轉(zhuǎn)入新的離心管中。

④加入等體積酚/氯仿，充分混勻，11 000 r/min，離心10 min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管。

⑤加入等體積氯仿，充分混勻，11 000 r/min，離心10 min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管。

⑥重復(fù)步驟④和⑤。

⑦加入2/3體積的異丙醇混勻，室溫放置，沉淀15 min。

⑧11 000 r/min，離心6 min，棄上清。

⑨將沉淀用φ=70%的乙醇漂洗1次，室溫條件下11 000 r/min離心2 min，棄上清，重復(fù)洗1次。

⑩往沉淀中加入50 μL 1×TE溶液，先混勻，再靜置30 min，中間過(guò)程顛倒混勻1～2次。

?提取產(chǎn)物取2～3 μL，用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其余置于-20 ℃保存，備用。

1.2.2 酶切 用識(shí)別四堿基的HpaⅡ和MspⅠ同裂酶(NEB) 分別與識(shí)別六堿基的核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ(NEB) 組合對(duì)樣本DNA進(jìn)行雙酶切，DNA 酶切反應(yīng)體系為20 μL。第1個(gè)反應(yīng)中，400 ng 樣本DNA，2 μL 10×Buffer 4(NEB)[50 mmol/L KAc、20 mmol/L Tris-acetate、10 mmol/L MgAc2、1 mmol/L dTT(pH 7.9，25 ℃)]，EcoRⅠ和HpaⅡ內(nèi)切酶各0.8 μL，37 ℃保溫過(guò)夜。第2個(gè)反應(yīng)中，400 ng 樣本DNA，2 μL 10×Buffer1(NEB) [10 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L dTT(pH 7.0，25 ℃)]，EcoRⅠ和MspⅠ內(nèi)切酶各0.8 μL，37 ℃保溫過(guò)夜。

1.2.3 連 接 在酶切片段的兩端加上人工設(shè)計(jì)的與EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ酶切位點(diǎn)互補(bǔ)的人工接頭(表1)。接頭連接體系為20 μL：2 μL 10×T4Buffer、0.4 μL 20 μmol/LEcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ接頭，其余用ddH2O補(bǔ)齊，16 ℃過(guò)夜。

1.2.4 預(yù)擴(kuò)增 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，其中含有0.4 μL 10 mmol/L dNTPs、2 μL 10×Buffer、0.2 μL 5 U/ μLTaq酶、0.5 μL 10 μmmol/L E00-primer、0.5 μL 10 μmmol/L M00-primer，其余用ddH2O補(bǔ)齊。反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，26 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍，供選擇擴(kuò)增用。

1.2.5 選擇性擴(kuò)增 選擇擴(kuò)增體系同預(yù)擴(kuò)增體系。條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，65 ℃至56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，13個(gè)循環(huán)，退火溫度每個(gè)循環(huán)降0.7 ℃進(jìn)行降式PCR擴(kuò)增；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，23 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

1.2.6 毛細(xì)管電泳 將甲酰胺與分子質(zhì)量?jī)?nèi)標(biāo)按100∶1的體積比混勻后，取9 μL加入上樣板中，再加入1 μL稀釋10倍的PCR產(chǎn)物。然后使用3730XL測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳。電泳結(jié)束后，利用GeneMarker 2.2 軟件對(duì)得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將各泳道內(nèi)分子量?jī)?nèi)標(biāo)的位置與各樣品峰值的位置做比較分析，得到片段大小。再根據(jù)無(wú)帶和有帶情況轉(zhuǎn)化為0/1數(shù)據(jù)矩陣。最后進(jìn)行甲基化率和甲基化模式比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，所提取樣本基因組 DNA主帶清晰，無(wú)降解現(xiàn)象(圖1)。再用紫外分光光度計(jì)測(cè)定，OD260/OD280比值為1.7～1.9，DNA的純度較高，極少含有蛋白質(zhì)，完全能滿足試驗(yàn)對(duì)DNA的要求。

2.2 預(yù)擴(kuò)增結(jié)果

預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物均勻彌散，且連續(xù)成片； 彌散帶只在100～1 000 bp低分子質(zhì)量區(qū)域出現(xiàn)，而在高分子質(zhì)量區(qū)域沒(méi)有出現(xiàn)，表明DNA消化完全，符合MSAP選擴(kuò)模板的要求。

表1 試驗(yàn)所用接頭和引物序列信息Table 1 Sequence information on adaptors and primers in this test

2.3 基因組DNA甲基化水平分析

依據(jù)HpaⅡ和MspⅠ對(duì)甲基化敏感程度不同，MSAP片段可分為4種類型：第Ⅰ類型EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ中均有條帶，甲基化的位點(diǎn)無(wú)改變；第Ⅱ類型EcoRⅠ/HpaⅡ有條帶而EcoRⅠ/MspⅠ中無(wú)條帶(僅有1條鏈甲基化的半甲基化位點(diǎn))；第Ⅲ類型EcoRⅠ/HpaⅡ無(wú)條帶(兩條鏈均甲基化)而EcoRⅠ/MspⅠ中有條帶；第Ⅳ類型EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ中均無(wú)條帶[12]。本試驗(yàn)采用10對(duì)選擇性擴(kuò)增引物組合(E32MSP40、E32MSP48、E35MSP48、E36MSP43、E37MSP48、E39MSP44、E40MSP44、E50MSP43、E78MSP40、E86MSP48)對(duì)雙酶切后的30個(gè)樣本進(jìn)行擴(kuò)增(圖2)。紅芽芋超低溫療法脫毒苗基因組DNA甲基化水平分析見(jiàn)表2。從表2可知，對(duì)照組總擴(kuò)增帶數(shù)522條，甲基化總帶數(shù)297條，總甲基化率57.06%，全甲基化帶數(shù)194條，全甲基化率37.22%，半甲基化帶數(shù)103條，半甲基化率19.84%；處理組總擴(kuò)增帶數(shù)504條，甲基化總帶數(shù)339條，總甲基化率67.33%，全甲基化帶數(shù)253條，全甲基化率50.2%，半甲基化帶數(shù)86條，半甲基化率17.13%。表明超低溫療法脫毒后，總甲基化率提高10.27%，全甲基化率提高12.98%，但半甲基化率下降2.71%。

編號(hào)1～30和M分別表示樣本1～30和Marker No. 1-30 and M represent samples 1-30 and marker,respectively

2.4 基因組DNA甲基化模式分析

紅芽芋經(jīng)過(guò)超低溫療法脫毒后，其基因組DNA甲基化模式有3種：第1種模式為甲基化條帶數(shù)無(wú)變化，可分為A1(非甲基化→非甲基化)、A2(半甲基化→半甲基化)、A3(全甲基化→全甲基化)3種類型，其比例為29.94%。第2種模式為去甲基化模式，可分為B1(半甲基化→非甲基化)、B2(全甲基化→非甲基化)、B3(超甲基化→非甲基化)、B4(超甲基化→半甲基化)、B5(超甲基化→全甲基化)5種類型，其比例為48.53%，表明紅芽芋經(jīng)過(guò)超低溫療法脫毒后在去甲基化模式中主要由甲基化位點(diǎn)變?yōu)榉羌谆稽c(diǎn)。第3種模式為甲基化模式，可分為C1(非甲基化→半甲基化)、C2(非甲基化→全甲基化)、C3(非甲基化→超甲基化)、C4(半甲基化→超甲基化)、C5(全甲基化→超甲基化)，其比例為18.20%。表明紅芽芋經(jīng)過(guò)超低溫療法脫毒后在甲基化模式中主要由非甲基化位點(diǎn)變?yōu)榧谆稽c(diǎn)。在第2種去甲基化模式中由甲基化位點(diǎn)變?yōu)榉羌谆稽c(diǎn)的比例為48.53%，在第3種甲基化模式中由非甲基化位點(diǎn)變?yōu)榧谆稽c(diǎn)的比例為18.20%(表3)。可見(jiàn)，在紅芽芋經(jīng)過(guò)超低溫療法脫毒后，甲基化和去甲基化并存，但主要是以去甲基化為主，說(shuō)明超低溫療法脫毒后較多的基因表達(dá)被激活。

每個(gè)引物擴(kuò)增圖左為HpaⅡ，右為MspⅠ Left of amplification of each primer wasHpaⅡ,and the right wasMspⅠ

圖2E32MSP40、E32MSP48、E35MSP48和E36MSP43引物組合對(duì)樣本1的MSAP擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)
Fig.2MSAPamplificationproducttestofsample1basedonE32MSP40,E32MSP48,E35MSP48andE36MSP43

3 討 論

病毒侵染植物是一種生物脅迫[13]。目前有關(guān)生物脅迫對(duì)植物的表觀遺傳影響的研究已有報(bào)道。一般集中于煙草花葉病毒等[14]。對(duì)感染煙草花葉病毒植物的后代進(jìn)一步分析顯示，它們的基因組已大幅度超甲基化[10]。后代的全基因組超甲基化被認(rèn)為是抵抗脅迫的一般保護(hù)機(jī)制的一部分，而重組事件的增加和由病毒攻擊導(dǎo)致的特異性甲基化模式可能是植物適應(yīng)性反應(yīng)的跡象[14]。而這種適應(yīng)性反應(yīng)的跡象將使植物的基因表達(dá)得到抑制，病毒的長(zhǎng)期積累將使植物的某些基因甲基化從而無(wú)法表達(dá)，最終導(dǎo)致植物的種性退化、產(chǎn)量和品質(zhì)下降。

研究表明，超低溫處理對(duì)植物材料的甲基化有一定程度的影響。朱文濤等[15]的研究表明，超低溫保存玻璃化法保存成活的五葉草莓甲基化水平降低6.73%，這與木瓜[16]、 蛇麻草[17]、擬南芥[18]等植物超低溫保存后的甲基化變化趨勢(shì)相類似。而超低溫療法脫毒是以超低溫保存的技術(shù)來(lái)快速有效脫除植物病毒，實(shí)質(zhì)上是解除病毒這種生物脅迫的過(guò)程。從理論上講，超低溫療法脫毒是解除病毒的生物脅迫，將會(huì)使植物的某些基因去甲基化，從而在一定程度上恢復(fù)植物的種性，提高其產(chǎn)量和品質(zhì)。

表2 紅芽芋超低溫療法脫毒苗基因組DNA甲基化水平分析Table 2 Analysis of genomic DNA methylation level in virus-free plantlets by cryotherapy of red bud taro

注：總甲基化率=[(Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100%；全甲基化率=[(Ⅲ+Ⅳ)]/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100%；半甲基化率=[Ⅱ/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100%。

Note:Total methylation rate=[(Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100%;full-methylation rate=[(Ⅲ+Ⅳ)]/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100%; hemi-methylation rate=[Ⅱ/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100%.

表3 紅芽芋超低溫療法脫毒苗基因組DNA甲基化模式分析Table 3 Analysis of genomic DNA methylation patterns in virus-free plantlets by cryotherapy of red bud taro

但超低溫療法脫毒不同于莖尖常規(guī)培養(yǎng)脫毒，在超低溫療法脫毒過(guò)程中牽涉到超低溫脅迫和滲透脅迫等非生物脅迫的因素，在解除病毒生物脅迫的同時(shí)，也遭受到超低溫脅迫和滲透脅迫等非生物脅迫。但目前的研究偏重于對(duì)超低溫保存后再生植株的甲基化研究，沒(méi)有考慮到脫毒方面的效應(yīng)，如王芳等[19]對(duì)馬鈴薯莖尖玻璃化法超低溫保存后的 DNA 甲基化遺傳變異進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)超低溫保存后去甲基化和甲基化都有發(fā)生，但以去甲基化變化為主。何艷霞等[20]在對(duì)擬南芥幼苗的超低溫保存研究中，也發(fā)現(xiàn)有去甲基化現(xiàn)象。這些研究表明，超低溫保存后植物材料存在去甲基化和甲基化，但去甲基化變化是主要趨勢(shì)。在本試驗(yàn)中，以超低溫療法脫毒的紅芽芋為研究對(duì)象，考察超低溫保存和脫毒對(duì)紅芽芋甲基化水平和甲基化模式的影響，發(fā)現(xiàn)超低溫療法脫毒苗總甲基化率提高10.27%，全甲基化率提高12.98%，但半甲基化率下降2.71%。紅芽芋超低溫療法脫毒苗去甲基化模式和甲基化模式并存，但去甲基化模式高于甲基化模式，說(shuō)明超低溫療法脫毒后有較多的基因表達(dá)被激活。究其原因，可能是脫毒和超低溫保存兩者平衡的結(jié)果，一是解除病毒生物脅迫，二是給予超低溫脅迫和滲透脅迫等非生物脅迫，最終去甲基化模式高于甲基化模式可能也是植物適應(yīng)性反應(yīng)的跡象，導(dǎo)致更多的基因得到表達(dá)，低溫療法脫毒可恢復(fù)種性的機(jī)理可以從甲基化水平和甲基化模式去解釋。這種變化趨勢(shì)可能是植物對(duì)超低溫保存這種逆境處理和病毒脅迫解除的一種綜合適應(yīng)，其內(nèi)在機(jī)制目前未明，需要深入探討。另外，超低溫療法脫毒中的甲基化能否引起基因的差異表達(dá)，也需要更深入地探討。本研究結(jié)果可為紅芽芋脫毒苗的種質(zhì)保存和規(guī)模化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。