水稻維生素B6與SSR標記的關聯分析

孫茂霖，孫 健，石 尚，劉化龍，鄭洪亮， 趙宏偉，謝冬微，王敬國，鄒德堂

(1.東北農業大學 農學院，哈爾濱 150030; 2. 黑龍江省農業科學院 經濟作物研究所，哈爾濱 150086)

水稻是世界上最重要的糧食作物之一。近年來，隨著市場對高品質稻米需求量的提升，在保證產量的前提下提高水稻的營養品質已成為水稻育種的熱點[1]。維生素作為人體必須的重要營養元素，是衡量水稻營養品質的重要指標[2]。維生素B6(Vitamine B6, VB6)又稱吡哆素，是一種水溶性維生素，包括吡哆醇(Pyridoxine,PN)、吡哆胺(Pyridoxamine,PM)、吡哆醛(Pyridoxal,PL)及它們的磷酸衍生物。VB6參與了細胞內的多種代謝，在生物體內發揮著極其重要的作用[3]。有研究表明，攝取足量的VB6能有效減少心血管疾病、高血壓、癲癇、糖尿病、腎臟疾病、神經系統疾病，糙皮病等疾病的發病率[3]。VB6的輔酶形式(PLP)可通過增強免疫系統和延緩腫瘤發展而對癌癥有積極的影響[4]。還有研究表明，神經疾病如抑郁癥、阿爾茨海默病、自閉癥，精神分裂癥、癲癇和帕金森病等均與VB6缺乏有關[5]。

植物和微生物是自然界中VB6的制造者，而動物只能從食物中獲取VB6。水稻作為人們的主食之一，也是重要的VB6來源[6]。如果其VB6增加，人體日常VB6的吸收量就會增加，有利于身體健康。但大多數水稻品種的VB6極低，因此，選育出富含VB6的品種對于保證人體健康具有重要意義。目前，國內外已有對影響VB6合成關鍵酶基因的報導，如Ehrenshaft等[7]在研究尾孢菌對自身毒素的抗性中發現了涉及VB6代謝的基因SOR1，后來鑒定為PDX1。隨后，該研究小組又從尾孢菌鑒定出涉及VB6合成的第2個基因PDX2[8]。Tambasco-studart等[9]在擬南芥中發現了參與VB6從頭合成途徑的4個基因，其中，有3個為PDX1的同源基因(AtPDX1.1,AtPDX1.2,AtPDX1.3)，還有1個為PDX2的同源基因(AtPDX2)。劉海峰[10]在水稻中同樣發現了PDX1的同源基因(OsPDX1.1,OsPDX1.2, OsPDX1.3)。

關聯分析(GWAS)是以連鎖不平衡為基礎，鑒定某一自然群體內目標性狀與分子標記或候選基因間關系的一種分析方法[11]，在水稻和其他作物中已被廣泛應用[12-14]。本研究以314份不同地理來源的水稻品種為材料，對其進行連續2 a的VB6測定，利用154對SSR標記與VB6進行關聯分析，旨在挖掘與VB6相關的SSR標記位點，為水稻高VB6的分子育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

314份水稻品種來源于黑龍江省104個、吉林省46個、遼寧省30個、日本92個、韓國19個、朝鮮11個、俄羅斯7個、法國3個、美國2個。分別于2016、2017年種植于東北農業大學實驗實習基地，4月中旬播種，5月中旬移栽，試驗地設計為行長3 m，雙行區，行距30 cm，穴距10 cm，3次重復，水肥病蟲害管理同一般大田管理。

1.2 VB6質量分數測定

水稻成熟收獲后，種子經過3個月的自然風干，使其生理生化性狀穩定。用糙米機將種子研磨成糙米，將糙米研磨成粉，過60目篩，采用蘇州科銘生物技術有限公司生產的VB6測定試劑盒測定樣品的VB6質量分數。其原理為VB6與4-氨基安替比林在強氧化劑作用下生成穩定的黃色化合物，在390 nm有特定吸收峰。記錄在390 nm的波長下的吸光值，代入標準曲線，計算得到樣本總VB6質量分數。對每個樣品測定3次，取平均值。

1.3 SSR標記分析

采用簡化的CTAB法[15]進行DNA提取。選取于水稻12條染色體上均勻分布的1 000對SSR標記，由上海生工生物工程有限公司合成。篩選出具有多態性的154對SSR引物對314份品種進行PCR擴增。

擴增體系包括3 μL的模板DNA(25 ng/μL)，2μL SSR引物(12 ng/μL)，2 μL PCR緩沖液，1.5 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.3 μLTaq酶(5 U/μL)，0.2 μL dNTP(10 mmol/L)，最后加入11 μL ddH2O使總體積達到20 μL。

PCR程序為94 ℃預變性6 min；38個循環(94 ℃下變性30 s，47 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s)；72 ℃下延伸5 min，4 ℃下保存。PCR擴增產物在6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳及銀染法檢測。

1.4 數據分析

采用Excel 2007軟件對VB6質量分數表型數據進行基本統計分析。

用STRUCTURE 2.3.4軟件進行群體結構分析[12]，估計最佳群體K，其取值范圍為2～8，參數iterations設為100 000，burn-in period設為1 000 000，每個K值重復運行5次。依據似然值最大的原則選取合適的K值作為群體數目，若對數似然值lnP(D) 隨亞群數K值的增大而增大，則采用ΔK來確定合適的K值[16-17]。

利用TASSEL 3.0軟件計算154個SSR標記位點兩兩之間的D′值，用于評價供試群體的LD程度(等位基因頻率<5%的稀有等位基因作為缺失處理)。以P≤0.01時，判定位點之間的LD達到顯著[18]。將STRUCTURE 2.3.4軟件運行后形成的Q值作為協變量，運用TASSEL 3.0軟件中的GLM和MLM模型，分別進行性狀與標記的關聯分析[19]。

將2 a在2種模型中均定位到的位點進行整理，以群體平均值為對照進行優異等位變異的挖掘，并計算優異等位變異的表型效應值[20]，同時篩選出具有該等位變異的優質品種。

2 結果與分析

2.1 VB6的變異分析

對2016與2017年測定的314個水稻品種的VB6變異進行統計分析(表1)，可以看出2016年品種的VB6的平均值為68.52 μg/g，變幅為39.70～127.24 μg/g，變異系數為14.78%。2017年品種的VB6的平均值為69.18 μg/g，變幅為42.95～138.48 μg/g，變異系數為15.32%。從2 a的VB6數據可知，不同品種間VB6變異范圍大，具有豐富多樣性。表2列出材料中VB6最高和最低的品種各10種，并按由高到低進行編號，發現最高的10個品種的VB6均高于80 μg/g，而最低的10個品種普遍低于50 μg/g，其中，‘龍錦1號’2 a平均VB6最高達到132.86 μg/g，‘花葉稻’在所有品種中2 a平均VB6最低僅有42.56 μg/g。在VB6最低的10個品種中，‘空育131’在黑龍江省被廣泛種植，但它的VB6僅有49.67 μg/g，有極高的改良價值。

2.2 群體結構分析

利用314個水稻品種的154個SSR標記基因型數據，通過STRUCTURE 2.3.4軟件進行群體結構分析。發現lnP(D)隨K持續上升，因此不能通過似然值最大的原則選取K值，需采用ΔK來確定合適的K值( 圖1)，發現K為3時ΔK最大，因此有3個亞群。圖2中314份供試材料被劃為由紅色、綠色和藍色代表的群體。每條豎線代表1份材料，豎線上的彩色片段代表材料所屬群體的比例。將比例超過65%的同種顏色的材料歸于同一亞群，其余材料歸于混合亞群。將亞群命名為第一亞群、第二亞群、第三亞群和混合亞群，發現第一亞群包含黑龍江品種53份，吉林品種17份，日本品種18份，俄羅斯品種2份，朝鮮品種1份；第二亞群包含黑龍江品種12份，吉林品種4份，俄羅斯品種5份，日本品種1份；法國品種1份；第三亞群包含遼寧品種29份，吉林品種16份，黑龍江品種9份，日本品種64份，朝鮮品種7份，韓國品種7份，美國品種2份；混合亞群包括黑龍江品種30份，吉林品種9份，遼寧品種1份，韓國品種12份，日本品種9份，朝鮮品種3份，法國品種2份。通過STRUCTURE 2.3.4軟件計算K為3時的Q值并用于關聯分析。

表1 314份水稻品種的VB6變異Table 1 Variation of VB6 in 314 rice varieties

表2 VB6極高和極低的部分水稻品種Table 2 Rice varieties with the highest and lowest VB6

2.3 連鎖不平衡分析

不同位點間的連鎖不平衡是關聯分析的基礎[21]。如圖3所示，以D′ 與P值繪制矩陣圖，用于觀測SSR位點之間LD的排列。通過154個SSR標記分析，在11 782個SSR位點成對組合中，不論是同一連鎖群還是不同連鎖群，都存在一定程度的LD。D′統計概率(P<0.01)支持的LD成對位點1 566個，占全部位點組合的13.3%，D′平均值為0.38，整體LD水平較高。

圖1 STRUCTURE軟件分析預測的lnP(D)和ΔKFig.1 Estimated lnP(D) and ΔK over ten repeats of structure analysis

圖2 群體結構(K=3)Fig.2 Population structure (K=3)

2.4 關聯分析

利用TASSEL3.0軟件中的GLM和MLM模型，對數據進行性狀與標記的關聯分析，當P≤0.01認為位點與性狀顯著關聯。由表3可知，2 a共檢測到與VB6相關的位點13個，其中2017年通過GLM模型定位到的RM254貢獻率最高為11.69%，所有位點的貢獻率范圍為3.87%～11.69%。2 a在至少一種模型中檢測到的位點有6個，分別是位于第11號染色體上的RM254，位于12號染色體的RM309，位于4號染色體的RM518，位于6號染色體的RM540，位于8號染色體的RM1271以及位于10號染色體的RM24856；其中，RM254、RM309和RM540在 2 a 2種模型中均被檢測到。

2.5 優異等位基因及載體材料

對2 a中在GLM和MLM模型中同時檢測到的3個顯著關聯的位點進行進一步的優異等位基因挖掘。因為標記間等位變異的表型效應值為正數時才對水稻的VB6有促進作用所以將2 a中表型效應大于零的優異等位變異進行整理，并同時列出攜帶該等位變異的3個最佳品種(表4)。由表4可知，2 a中優異等位基因共8個，其中，RM254-200、RM254-205、RM309-185、RM540-205、RM540-215、RM540-230在2 a中均被發現，RM540-230 表型效應值最高分別達到了6.23和5.91。2 a中發現較優載體材料‘遼星6’‘越實’‘花臉’等有較高VB6且至少含有2個以上優異等位變異。

圖3 供試材料154個SSR位點間連鎖不平衡的分布Fig.3 The LD distribution of 154 loci in the detected accessions

年份 Year方法 Method標記 Maker染色體 ChromosomeP值 P value貢獻率/% R22016GLMRM20826.16E-033.99RM254111.61E-0611.37RM309122.28E-045.84RM51587.68E-034.64RM51841.26E-048.15RM54063.12E-058.65RM54788.82E-035.89RM58311.20E-037.46RM127154.55E-035.75RM131321.18E-036.41RM24856105.79E-036.51MLMRM254119.08E-047.52RM309123.92E-034.04RM51846.92E-035.29RM54066.07E-035.05RM131323.63E-035.922017GLMRM15281.94E-034.68RM254119.29E-0711.69RM309123.21E-045.62RM51844.55E-047.24RM54066.35E-058.11RM127159.74E-035.12RM136964.47E-037.06RM24856101.29E-037.68MLMRM254111.44E-048.92RM309124.98E-033.87 RM54064.82E-035.21

表4 與VB6相關的優異等位變異及載體材料Table 4 Excellent alleles associated with VB6 in the materials

3 討論與結論

VB6作為一種日常必需的維生素，在人體中發揮著重要的作用。但在水稻中對VB6的研究較少，并未有關聯分析方面的報導。因此，通過關聯分析挖掘與VB6相關的SSR標記，對后續研究有重要意義。本研究采用的314個水稻品種組成的群體材料來自于不同國家和地區，它們地理來源廣泛，同時對品種的VB6變異進行統計分析，發現不同品種間VB6變異范圍大，具有豐富多樣性，是進行關聯分析良好材料。對VB6最高和最低的品種進行整理，發現‘龍錦1號’‘遼星6’‘花臉’等10個品種VB6最高，達到80 μg/g以上。‘花葉稻’‘公苗糯’‘空育131’等10個品種VB6最低，普遍低于50 μg/g。在VB6最低的10個品種中，‘空育131’在黑龍江省被廣泛種植，可通過與VB6較高的品種‘龍錦1號’和‘遼星6’等雜交，進行改良。

群體遺傳結構分析是關聯分析的前提[22-23]。本研究通過對群體結構分析減少了群體分類對關聯分析的影響，避免人為因素對亞群劃分的影響。通過STRUCTURE 軟件對供試材料進行群體結構分析并劃分為3個亞群，并將所得Q值作為協變量納入計算，降低了亞群混合造成的偽關聯概率，使關聯分析結果更具準確性。此外，研究通過2 a的2種模型(GLM模型和MLM模型)對SSR標記與VB6進行關聯分析。其中，MLM模型不僅考慮了群體結構Q值，同時還考慮了親緣關系K值，使檢測到的標記數目少于GLM模型中的標記數。同時對2 a的2種模型的結果進行分析，得到的結論更有全面性更可靠。

通過2 a的2種模型對與VB6相關的位點進行挖掘，共檢測到與VB6相關的位點13個，貢獻率范圍為3.87%～11.69%，其中RM254、RM309和RM540在2 a的2種模型中均被檢測到，RM254貢獻率最高為11.69%。在研究發現的位點中，RM24856與水稻中的PDX1基因的同源基因OsPDX1.2位置相近，該基因已被證實能影響水稻VB6，超量表達該基因能提高水稻VB6水平[10]。RM24856位點位于第10染色體上的95 524 bp～95 543 bp，OsPDX1.2位于第10染色體上的80 964～82 250，兩者距離僅13 274 bp，RM24856位點極有可能與OsPDX1.2連鎖。

進一步對RM254、RM309和RM540位點的優異等位變異進行挖掘，發現優異等位基因共8個，其中RM254-200、RM254-205、RM309-185、RM540-205、RM540-215、RM540-230在2 a中均被發現，RM540-230 表型效應值在2 a最高中最高，分別達到6.23和5.91。挖掘出有較高VB6且聚合了與VB6相關的優異等位變異的載體材料‘遼星6’‘越實’‘花臉’等，可作為親本用于日后的分子輔助育種。