高效提取3種不同類型植物葉片色素的方法

周武先，段媛媛，盧 超,2，艾倫強(qiáng),2， 何銀生,2，張美德,2

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 中藥材研究所，湖北恩施 445000； 2.湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心 中藥材研究分中心，湖北恩施 445000)

高等植物葉片色素的構(gòu)成主要包括葉綠素和類胡蘿卜素，葉綠素主要分為葉綠素a和葉綠素b，類胡蘿卜素主要分為胡蘿卜素和葉黃素。葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要成分，也是反映植物生理狀況的重要指標(biāo)[1]。王春明等[2]的研究結(jié)果顯示，葡萄葉片葉綠素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的降幅與葉片病情指數(shù)呈顯著正相關(guān)，表明葡萄葉片葉綠素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)降幅可作為葡萄對霜霉病抗性鑒定的輔助指標(biāo)。類胡蘿卜素作為光合作用中的輔助色素，不僅參與光能的吸收和傳遞，還具有抗氧化[3]、抗癌[4]及抗輻射[5]的作用。因此，葉綠素和類胡蘿卜素的提取及測定在相關(guān)科研工作和生產(chǎn)中尤為重要。提取植物組織中色素的主要有機(jī)溶劑包括氯仿、石油醚、丙酮、乙醇和二甲基亞砜等[6-8]，通常使用丙酮和乙醇按一定比例混合或其水溶液提取植物色素[9-10]。目前丙酮提取法使用最廣泛，最早于1941年由Mackinney[11]提出，1949年Arnon對此法進(jìn)行解釋和推導(dǎo)[12]。該法的產(chǎn)生革新了最早的葉綠素皂化測定法，操作相對簡單，耗時(shí)大幅縮短。丙酮提取法主要是使用80%丙酮進(jìn)行研磨，然后經(jīng)過洗轉(zhuǎn)、過濾和定容等步驟，過程較為復(fù)雜，且色素測定值偏低[13]。舒展等[13]將此法進(jìn)行改進(jìn)并提出葉綠素簡化提取法，即將植物綠色組織剪碎后直接使用80%丙酮浸提。這一方法大大簡化操作過程，節(jié)省植物材料和試劑的用量，但提取時(shí)間過長，一般需要24～72 h才能提取完全[14]。邱念偉等[14]發(fā)明DMSO-80%丙酮兩步快速提取法，先用DMSO高溫提取葉綠素，再用80%丙酮稀釋浸提，可以有效減小測定誤差，加快測定速度，將提取時(shí)間縮短至3 h。吳志旭等[15]改用熱丙酮浸提葉綠素，使浸提時(shí)間縮短為1.5～2.5 h。即便如此，以上方法仍較為繁瑣，提取時(shí)間較長或存在安全隱患，客觀上難以做到避光操作，因而色素提取效率不高。

本研究綜合以上測定方法的優(yōu)缺點(diǎn)，旨在建立一種高效快速測定植物葉片色素的方法，簡稱液氮法，即使用液氮對植物葉片進(jìn)行快速冷卻，使用鋼珠或研缽迅速粉碎植物葉片組織，再使用溶劑進(jìn)行提取。該法對角質(zhì)層薄、細(xì)胞排列松散的葉片組織色素提取可以做到完全避光，防止色素降解；對角質(zhì)層較厚、細(xì)胞排列緊密的葉片，也可有效提高色素提取效率。使用該法篩選不同類型葉片色素提取的最佳溶劑、溫度和時(shí)間及確定葉片與溶劑的最佳質(zhì)量體積比，即可精確快速測定不同類型葉片組織中的色素含量。

1 材料與方法

1.1 材 料

中華蚊母樹(Distyliumchinense(Fr.) Diels)、梔子樹(GardeniajasminoidesEllis)和油麥菜(Lactucasativavarlongifoliaf. Lam)的葉片分別作為典型的角質(zhì)層厚、細(xì)胞排列緊密(葉片硬厚)，角質(zhì)層中等、細(xì)胞排列較緊密(葉片較厚)和角質(zhì)層薄、細(xì)胞排列松散(葉片軟薄)的 3 種葉片類型，用于不同結(jié)構(gòu)葉片的色素提取效率研究。中華蚊母樹葉片采自華中藥用植物園，梔子樹葉片采自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所，油麥菜葉片購自恩施市菜市場，均于2018年4月10日完成采摘或購買。選用顏色均一、去除葉脈的成熟葉片，使用前充分剪碎、混勻，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2 方 法

1.2.1 葉片的橫切面結(jié)構(gòu) 采用卡寶品紅染色法[16]觀察 3 種不同類型葉片的橫切面結(jié)構(gòu)。將葉片洗凈，吸水紙擦干，切薄片置于載玻片，滴適量卡寶品紅染色液，染色3～5 min，蓋上蓋玻片，使用尼康生物顯微鏡(NIKON Eclipse E200)觀察葉片橫切面結(jié)構(gòu)。

1.2.2 提取方式 分別采用液氮法、研磨法和浸提法3 種方式對3種不同類型葉片中的色素進(jìn)行提取，篩選不同類型葉片色素的最佳提取方法。液氮法(MLN)：稱取0.1 g葉片(角質(zhì)層薄、細(xì)胞排列松散)到裝有鋼珠的10 mL離心管中，倒入液氮，在液氮剛好揮發(fā)完時(shí)蓋上離心管蓋置于渦旋儀上渦旋，重復(fù)以上操作直至葉片充分粉碎，用錫箔紙裹住離心管，加入8 mL提取溶劑，4 ℃避光提取10 min；或稱取0.1 g葉片(角質(zhì)層較厚、細(xì)胞排列緊密)加入到事先預(yù)冷(4 ℃)的研缽中，倒入少許液氮進(jìn)行充分研磨，使用8 mL提取溶劑分4次將研磨液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，4 ℃避光提取10 min；液氮法提取色素的過程中反復(fù)顛倒離心管3～5次。研磨法(MG)：稱取0.1 g葉片到研缽中，加入少許石英砂充分研磨，使用8 mL提取溶劑進(jìn)行洗轉(zhuǎn)，常溫(25 ℃)下避光提取30 min。浸提法(ME)：將葉片充分剪碎，稱取0.1 g葉片到離心管中，加入8 mL提取溶劑，常溫避光提取24 h。

1.2.3 提取溶劑 分別使用8種有機(jī)提取溶劑對不同類型植物葉片的色素進(jìn)行提取。8種溶劑為A:φ=80%丙酮；B:φ=95%乙醇；C: 丙酮∶乙醇= 1∶1(體積比)；D∶丙酮∶乙醇= 2∶1 (體積比)；E: 丙酮∶乙醇= 1∶2 (體積比)；F: 丙酮∶乙醇∶水= 6∶3∶1 (體積比)；G: 丙酮∶乙醇∶水= 3∶6∶1(體積比)；H: 丙酮∶乙醇∶水= 4.5∶4.5∶1(體積比)。稱取0.1 g 3 種不同類型的植物葉片，統(tǒng)一采用液氮法對葉片進(jìn)行處理，分別使用8種溶劑，4 ℃避光提取10 min后測定各色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.4 環(huán)境因素 研究不同溫度、光照條件及提取時(shí)間對不同類型植物葉片色素提取的影響。溫度分別設(shè)置-20、4、25和37 ℃ 4 個(gè)梯度，光照度設(shè)置0、100、1 000 lx 3 個(gè)梯度，提取時(shí)間設(shè)置1、3、5、10、20、30、60 min 7 個(gè)梯度。溶劑統(tǒng)一使用φ=80%丙酮，分別提取3種不同類型葉片的色素。

1.2.5 質(zhì)量體積比 為確定不同類型葉片色素提取過程中葉片質(zhì)量與提取溶劑的最佳比例，按葉片質(zhì)量(g)與溶劑體積(mL)分別為1/25、1/50、1/100、1/200、1/400設(shè)置，使用液氮法進(jìn)行色素提取，在最佳提取溶劑、溫度、光照條件及最適提取時(shí)間下探索不同類型葉片色素提取的最佳質(zhì)量體積比。

1.3 葉綠素和類胡蘿卜素的測定

趙先明等[9]和楊敏文[17]的研究結(jié)果顯示，葉綠素在8 種不同溶劑中的光吸收特性類似，因此可使用Arnon公式計(jì)算葉綠素和類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，均以鮮質(zhì)量計(jì)。但研究表明，Arnon法在吸收波長和計(jì)算公式方面均有較大誤差[14]，為了提高效率和研究方便，本研究采用Wellburn等[18]于1984年修正的葉綠素和類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算公式。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007、SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，使用origin 8.1作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種不同類型葉片的剖面結(jié)構(gòu)

從圖1可以看出，中華蚊母樹的葉片角質(zhì)層厚、細(xì)胞排列緊密(圖1-A)；梔子樹的葉片角質(zhì)層中等、細(xì)胞排列較緊密(圖1-B)；油麥菜葉片的角質(zhì)層薄、細(xì)胞排列松散、無規(guī)則(圖1-C)。

1.角質(zhì)層 Cuticula；2.上表皮 Upper epidermis；3.葉肉組織 Mesophyll tissue；4.下表皮 Lower epidermis

2.2 最佳提取方式

由表1可知，液氮法提取的中華蚊母樹葉片中的葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于其他提取方法(P<0.05)，達(dá)到0.55 mg·g-1，總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相比于浸提法分別高出100.0%和212.5%，但與研磨法差異不顯著(P>0.05)。使用 3 種不同提取方式提取的梔子樹葉片各色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在顯著性差異(P<0.05)，液氮法的提取效率最高，葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相比于研磨法和浸提法分別高出32.9%、58.6%、27.9%和109.6%、411.1%、129.2%。油麥菜葉片中的色素以液氮法提取效果最好，但幾種提取方式提取的葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著性差異。

表1 不同提取方式下中華蚊母樹、梔子樹以及油麥菜葉片色素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Effects of different extraction methods on extraction efficiency of extracting pigments from leaves of Distylium chinense, Gardenia and lettuce

注：每種葉片類型的結(jié)果顯著性差異單獨(dú)分析；同列不同小寫字母表示不同處理差異顯著(P<0.05)；下同。

Note: Results of leaves of each type are analyzed separately, different lowercase letters in same column indicate significant difference among various treatments(P<0.05); the same below.

2.3 最佳提取溶劑

如圖2，中華蚊母樹葉片的最佳提取溶劑為丙酮∶乙醇：水= 4.5∶4.5∶1的混合溶液(圖2-A)，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.55、0.17 和0.21 mg·g-1，提取效果顯著高于φ=80%丙酮、φ=95%乙醇及丙酮∶乙醇∶水= 6∶3∶1的混合溶液。梔子樹葉片以丙酮∶乙醇∶水= 4.5∶4.5∶1的混合溶液浸提效果最好(圖2-B)，葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.20、0.30 和0.43 mg·g-1，提取效果與φ=95%乙醇及丙酮∶乙醇= 1∶1的混合溶液差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于其他提取溶劑。油麥菜葉片色素的最佳提取溶劑為φ=95% 乙醇(圖2-C)，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.58、0.48 和0.65 mg·g-1，以丙酮∶乙醇∶水=4.5∶4.5∶1的混合溶液提取效果最差，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.31、0.30和0.50 mg·g-1，色素提取效率顯著低于φ=95%乙醇溶液(P<0.05)。

圖2 不同溶劑對中華蚊母樹、梔子樹以及油麥菜葉片色素提取效率的影響Fig.2 Effects of different extraction solvents on efficiency of extracting pigments from leaves of Distylium chinense, Gardenia and lettuce

2.4 最佳提取溫度、時(shí)間及光照條件

表2顯示， 3 種不同類型葉片色素的最佳提取溫度均為4 ℃。當(dāng)溫度為-20～4 ℃時(shí)，隨著溫度升高，色素提取效率逐漸增加；當(dāng)溫度為4～37 ℃時(shí)，隨著溫度升高，色素提取效率逐漸降低，說明溫度過低或過高都會影響葉片中各色素的溶出效率。

從表3可得，隨著光照強(qiáng)度的增加， 3 種不同類型葉片中的色素提取量逐漸降低。黑暗條件下各色素的提取效果最好，葉綠素a和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于1 000 lx光照度處理(P<0.05)，不同光照度處理下葉綠素b的提取效率差異不顯著(P>0.05)。

表2 不同溫度下中華蚊母樹、梔子樹及油麥菜葉片色素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Effects of different extraction temperatures on efficiency of extracting pigments from leaves of Distylium chinense, Gardenia and lettuce

從圖3可以看出，隨著浸提時(shí)間的延長，不同類型葉片中各色素的提取量逐漸增加。中華蚊母樹葉片和梔子樹葉片研磨提取10 min后色素提取量達(dá)到最大，隨后基本保持不變；油麥菜葉片浸提5 min后提取量達(dá)到最大，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.25、0.40和 0.57 mg·g-1，浸提時(shí)間超過5 min后，各色素提取量基本保持不變。

表3 不同光照度下中華蚊母樹、梔子樹以及油麥菜葉片色素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 3 Effects of different extraction light intensities on efficiency of extracting pigments from leaves of Distylium chinense,Gardenia and lettuce

圖3 不同浸提時(shí)間對中華蚊母樹、梔子樹以及油麥菜葉片色素提取效率的影響Fig.3 Effects of different extraction time on efficiency of extracting pigments from leaves of Distylium chinense,Gardenia and lettuce

2.5 最佳質(zhì)量體積比

從圖4可以看出，3 種不同類型的葉片質(zhì)量與提取溶劑的比例為1∶100時(shí)，葉片中的各色素提取量最大。當(dāng)葉片與溶劑的質(zhì)量體積比大于1∶100時(shí)，各色素的提取量隨質(zhì)量體積比減小而增加；而當(dāng)葉片與溶劑質(zhì)量體積比小于1∶100時(shí)，色素的提取量隨質(zhì)量體積比減小而減小，并在1∶400時(shí)最低。葉片與溶劑的質(zhì)量體積比為1∶200～1∶50時(shí)各色素提取量無顯著性差異(P>0.05)，是浸提 3 種不同類型葉片色素較為理想的范圍。

3 討 論

本研究中3種不同類型葉片的橫切面結(jié)構(gòu)顯示，中華蚊母樹葉片的角質(zhì)層最厚，且細(xì)胞排列緊密；梔子樹葉片的角質(zhì)層厚度次之，細(xì)胞排列較緊密；油麥菜葉片的角質(zhì)層最薄，細(xì)胞排列松散、無規(guī)則；因此以上 3 種植物葉片可作為色素提取效率研究的良好材料。

植物組織中色素的提取方式不同，色素的提取效果也不一樣[9, 19]。本研究中 3 種不同類型的葉片色素提取效率均以液氮法最佳。推測原因如下：葉片的形態(tài)、溫度及光照條件均會不同程度影響葉片色素的提取或降解。葉片使用液氮處理后，易于充分粉碎并縮短色素提取操作時(shí)長，減少曝光時(shí)間，降低色素的降解速度；同時(shí)，液氮可瞬間凝結(jié)葉片，降低葉片溫度，防止因溫度過高造成色素降解。不同葉片類型使用同一提取方式的效果不同。本研究中角質(zhì)層厚的蚊母樹葉片和梔子樹葉片使用研磨法提取的效率高于浸提法，這可能與蚊母樹和梔子樹葉片角質(zhì)層厚、細(xì)胞排列致密且表層具有較厚的蠟質(zhì)層而導(dǎo)致浸提過程中色素?zé)o法充分溶出有關(guān)。油麥菜葉片因角質(zhì)層薄、細(xì)胞排列松散，色素提取溶劑易于滲入葉片細(xì)胞，色素溶出率高，同時(shí)使用浸提法可避免研磨法操作過程中因光照和洗轉(zhuǎn)造成色素?fù)p失，因而油麥菜葉片使用浸提法提取色素的效率高于研磨法。

圖4 葉片與溶劑的質(zhì)量體積比對中華蚊母樹、梔子樹及油麥菜葉片色素提取效率的影響Fig.4 Effects of different mass/volume ratios of leaves to solvents on efficiency of extracting pigments from leaves of Distylium chinense, Gardenia and lettuce

本研究中中華蚊母樹葉片和梔子樹葉片的最佳提取溶劑均為丙酮∶乙醇∶水= 4.5∶4.5∶1的混合溶劑，這與張秀君等[19]和李得孝等[20]關(guān)于菠菜和玉米的色素提取研究結(jié)果類似，最佳提取溶劑均為混合溶劑，說明丙酮∶乙醇∶水= 4.5∶4.5∶1的混合溶劑對中華蚊母樹和梔子樹葉片色素的協(xié)同萃取效果較好。而油麥菜葉片中的色素以φ=95%乙醇提取效果最好，丙酮∶乙醇∶水= 4.5∶4.5∶1混合溶劑的色素提取效果最差，說明油麥菜葉片色素在φ=95%乙醇中的溶出率較高，混合溶劑對油麥菜葉片色素的協(xié)同萃取效果較差，這可能與植物葉片細(xì)胞的構(gòu)造差異有關(guān)。 3 種不同類型葉片色素提取效率從高到低的溶劑排序分別為：(1) 中華蚊母樹，丙酮∶乙醇∶水(4.5∶4.5∶1)>丙酮∶乙醇( 2∶1)>丙酮∶乙醇(1∶2)>丙酮∶乙醇∶水(3∶6∶1)>丙酮∶乙醇(1∶1)>丙酮∶乙醇∶水(6∶3∶1)>φ=95%乙醇>φ=80%丙酮；(2) 梔子樹，丙酮∶乙醇∶水(4.5∶4.5∶1)>φ=95%乙醇>丙酮∶乙醇(1∶1)>丙酮∶乙醇= 2∶1>丙酮∶乙醇∶水(6∶3∶1)>丙酮∶乙醇∶水(3∶6∶1)>φ=80%丙酮>丙酮∶乙醇(1∶2)；(3) 油麥菜，φ=95%乙醇>丙酮∶乙醇(2∶1)>丙酮∶乙醇(1∶1)>丙酮∶乙醇∶水(3∶6∶1)>丙酮∶乙醇∶水(6∶3∶1)>丙酮∶乙醇(1∶2)>丙酮∶乙醇∶水(4.5∶4.5∶1)>φ=80%丙酮。從中可得，中華蚊母樹和梔子樹葉片色素以丙酮∶乙醇∶水= 4.5∶4.5∶1混合溶劑的提取效果最佳，而油麥菜葉片色素以丙酮∶乙醇∶水= 4.5∶4.5∶1的混合溶劑提取效果最差，說明同一溶劑對不同類型葉片中的色素提取效果不同；另外可看出，φ=80%丙酮對不同類型葉片色素的提取效果均較差，因此在科研工作或工業(yè)生產(chǎn)中要求精確測定植物色素時(shí)應(yīng)避免使用。

在提取植物組織中的色素時(shí)，提取溫度、時(shí)間和葉片與溶劑的質(zhì)量體積比都會影響色素的提取效果[9]。中華蚊母樹葉片和梔子樹葉片色素的最佳提取溫度、時(shí)間和葉片與溶劑的質(zhì)量體積比分別為4 ℃、10 min和1/100；油麥菜葉片色素的最佳提取溫度、時(shí)間和葉片與溶劑的質(zhì)量體積比分別為4 ℃、5 min和1/100。小于或超過最佳條件均會不同程度影響色素的提取效果，這與張秀君等[19]的研究結(jié)果相似。說明植物葉片色素的溶出效率和降解速度與提取溫度、時(shí)間及葉片與溶劑的質(zhì)量體積比有關(guān)；油麥菜葉片色素的提取時(shí)長比中華蚊母樹和梔子樹葉片更短，說明色素的溶出效率與植物葉片的結(jié)構(gòu)有關(guān)，角質(zhì)層薄、細(xì)胞排列松散的葉片比角質(zhì)層厚、細(xì)胞排列緊密的葉片色素溶出速度快。此外，光照會引起色素的快速降解，光照強(qiáng)度越大，色素降解速度越快，因此提取色素的過程中應(yīng)盡量避免光照。

本研究采用中華蚊母樹、梔子樹及油麥菜的葉片作為 3 種不同類型的葉片代表，用于探索高效快速提取植物葉片色素的最佳方式，發(fā)現(xiàn)不同類型葉片色素的提取均以液氮法提取效率最高，且整個(gè)測定過程時(shí)間最短。對于角質(zhì)層薄、細(xì)胞排列松散的植物葉片，色素的提取過程可完全避免光照，防止色素降解，增加色素的提取效率，同時(shí)大幅縮短提取時(shí)間。以油麥菜葉片為例，色素提取完全僅需5 min。對于角質(zhì)層較厚、細(xì)胞排列緊密的植物葉片，液氮?dú)饣^程能瞬間凝結(jié)葉片并降低葉片組織的溫度，有利于提高研磨效率并使研磨更加充分，同時(shí)研磨過程保持在較低溫度下進(jìn)行，可以有效防止色素降解，以中華蚊母樹和梔子樹葉片為例，整個(gè)色素提取過程不超過10 min。相比以往的色素提取研究，該法提取過程操作簡單、耗時(shí)短、效率高、測定結(jié)果穩(wěn)定，可用于科研工作和工業(yè)生產(chǎn)中對植物葉片色素的快速提取與精確測定。