涇陽茯茶生產(chǎn)環(huán)境中冠突散囊菌多樣性檢測

孟令緣,施東妮,盛煥精,葛武鵬, 賀玉鋒,毛敏輝 ,楊保偉

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100; 2.西咸新區(qū)市場服務(wù)與監(jiān)督管理局涇河新城分局, 陜西涇陽 713700; 3.西咸新區(qū)涇河新城城鄉(xiāng)管理局,陜西涇陽 713700)

涇陽茯茶是一種全發(fā)酵茶，長期飲用能有效調(diào)節(jié)人體新陳代謝、促進(jìn)消化，并有一定程度的疾病預(yù)防和保健作用[1-3]，在中國西北和蒙古等游牧民族活動地區(qū)深受消費者喜愛[4-6]。

茯茶生產(chǎn)中的“發(fā)花”工序?qū)嶋H是“金花菌”在茶葉中生長繁殖，產(chǎn)生淀粉酶、纖維素酶和果膠酶等有益成分，從而改善茶葉口感、風(fēng)味和品質(zhì)的過程[7-8]。因此，“金花菌”的數(shù)量常作為茯茶品質(zhì)評價的一項重要指標(biāo)。然而，關(guān)于茯茶中“金花菌”的多樣性研究結(jié)果并不一致，對“金花菌”的分類鑒定尚存在分歧[9-13]。陜西涇陽是中國茯茶的發(fā)源地及現(xiàn)存主要產(chǎn)地之一，茯茶生產(chǎn)領(lǐng)域也比較認(rèn)可“金花菌”為冠突散囊菌，但未見對涇陽茯茶產(chǎn)區(qū)“金花菌”多樣性進(jìn)行研究的報道。

本研究對采集自陜西涇陽茯茶廠部分樣品中的“金花菌”進(jìn)行分離，并對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，旨在闡明涇陽地區(qū)不同茯茶生產(chǎn)廠區(qū)、工段和環(huán)境中冠突散囊菌的多樣性，以期為茯茶工業(yè)化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茶葉和茯茶生產(chǎn)環(huán)境樣品分別采集自陜西涇陽涇磚茶業(yè)(賈根社)有限公司(生產(chǎn)方式為傳統(tǒng)手工生產(chǎn))和涇陽涇普茶業(yè)有限公司(生產(chǎn)方式為現(xiàn)代化、機(jī)械化工業(yè)生產(chǎn))。采集的樣品和數(shù)量具體為：茶葉樣品 15份(原料茶5份，渥堆茶3份，“金花菌”發(fā)花期半成品茯茶2份，成品茯茶5份)，生產(chǎn)環(huán)境空氣沉降樣34份，“金花菌”發(fā)花室窗臺和地板涂抹樣4份，土壤樣品5份，工廠墻壁涂抹樣2份，茶釉樣品3份。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基和BPW肉湯購自北京陸橋生物科技有限公司，按使用說明配制，121 ℃滅菌20 min后，PDA和察氏培養(yǎng)基倒入一次性無菌培養(yǎng)皿制備平板，凝固后密封保存，備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集 茶葉樣品采集：戴上一次性無菌手套，分別從混合均勻的原料茶和渥堆茶不同位置隨機(jī)采集約250 g，裝入無菌均質(zhì)袋，密封保存，備用。發(fā)花半成品茯茶和成品茯茶各隨機(jī)采集3塊茶餅，實驗室無菌條件下打散、混勻后取樣。空氣沉降樣品采集：培養(yǎng)皿做好標(biāo)記后，打開PDA與察氏培養(yǎng)基皿蓋，將培養(yǎng)基置于茶廠的發(fā)花室內(nèi)、成品儲藏室、廠區(qū)院落和走廊等地，暴露15 min后，蓋上皿蓋， 28 ℃培養(yǎng)5～8 d。

涂抹樣品采集：使用無菌BPW潤濕3～5根無菌棉簽，分別擦取生產(chǎn)車間的窗臺、走廊和墻角等位置的浮塵，每樣品采樣面積約10 cm×10 cm。采樣后使用無菌剪刀剪下棉簽頭部，裝入50 mL無菌離心管，密封保存，備用。

1.3.2 冠突散囊菌分離 茶葉中冠突散囊菌分離。方法一：用無菌鑷子夾取茶葉少許，分別置于PDA與察氏培養(yǎng)基表面，輕壓使茶葉和培養(yǎng)基充分接觸，28 ℃培養(yǎng)5～8 d。

方法二：稱取茶葉25 g，置于裝有225 mL無菌蒸餾水的三角瓶中，充分振蕩，即為10-1樣品稀釋液。倍比稀釋，依次得到10-2、10-3、10-4、10-5和10-6濃度樣品稀釋液。分別取10-1、10-2和10-3稀釋液在PDA和察氏培養(yǎng)基上連續(xù)劃線，28 ℃培養(yǎng)5～8 d。疑似菌單菌落在PDA平板多次純化后轉(zhuǎn)接PDA斜面，28 ℃培養(yǎng)7 d后用無菌石蠟密封，4 ℃冰箱保存，備用。

為了盡可能分離出茶葉中的冠突散囊菌，研究同時采用涂布法，將1 mL 10-2、10-4和10-6樣品稀釋液分別滴加于PDA和察氏培養(yǎng)基，涂布均勻，28 ℃培養(yǎng)5～8 d，挑取典型菌落，純化后石蠟密封保存，備用。

空氣沉降樣品中冠突散囊菌分離。空氣沉降樣品于28 ℃培養(yǎng)5～7 d，挑取典型菌落，純化后石蠟密封，4 ℃保存，備用。

土壤中冠突散囊菌分離。具體方法同茶葉中冠突散囊菌的分離。

涂抹樣品中冠突散囊菌分離。向保存棉簽頭的離心管中加入10 mL無菌BPW，充分振蕩后，取懸液分別劃線于PDA和察氏培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5～8 d，挑取典型菌落，純化后保存。

1.3.3 形態(tài)學(xué)鑒定 疑似冠突散囊菌劃線接種于PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5～7 d。將適量無菌水加到PDA培養(yǎng)基表面，用無菌刮鏟輕刮菌落(苔)，得到菌懸液。吸取0.5 mL菌懸液涂布于另一PDA培養(yǎng)基后，將無菌蓋玻片以45°斜角插入培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)6～8 h后取出4～6片，于蓋玻片上滴加少許石炭酸棉蘭染液進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)和菌絲分化情況。之后，每隔6～8 h，取出4～6片蓋玻片，用吸水紙擦去生長相對較差玻片一面的菌絲后，石炭酸棉蘭染色。染色標(biāo)本在自動攝像顯微鏡下觀察，選取代表性菌絲及相應(yīng)結(jié)構(gòu)，拍照記錄。

1.3.4 分子生物學(xué)鑒定 使用TAKARA真菌基因組提取試劑盒(No.9768；TAKARA MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit)提取疑似菌的總DNA，參照TAKARA真菌鑒定試劑盒(No.RR178，F(xiàn)ungi Identification PCR Kit)說明，對疑似菌的26S rDNA D1/D2區(qū)和ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，低溫條件下送北京奧科生物科技有限公司測序。將測得的26S rDNA D1/D2區(qū)和ITS序列提交NCBI基因庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，通過Blast進(jìn)行同源檢索，下載同源序列。使用Mega 6.0軟件對菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)及ITS序列和下載的同源序列進(jìn)行比對，采用鄰接法(Neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自舉(Bootstrap)1 000次重復(fù)對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行檢驗以鑒定菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離及形態(tài)學(xué)鑒定

共分離得到26株疑似冠突散囊菌(圖1中米粒狀黃色菌落即為疑似冠突散囊菌)。菌絲不發(fā)達(dá)，呈匍匐狀生長，PDA培養(yǎng)基上生長較快。5 d后PDA培養(yǎng)基上菌落直徑為11～16 mm，圓形，結(jié)構(gòu)致密。菌落邊緣的新生菌絲生長旺盛，乳白至淺黃色，中央呈金黃色至深褐色，有少量褐色滲出液，菌落背面呈深褐色。在察氏培養(yǎng)基上生長較慢，7 d后培養(yǎng)基顏色在滲出物的影響下逐漸變深(圖2)。

光學(xué)顯微鏡(10×40倍)檢測發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)12 h后孢子萌發(fā)，分化出一級菌絲；24～48 h可見菌絲橫隔膜；48～72 h部分菌絲末端出現(xiàn)卷曲，進(jìn)一步分化；72 h后可見球狀閉囊殼，內(nèi)有大量金黃色孢子。閉囊殼成熟后破裂，孢子釋放，完成一個生長期(圖3)。依據(jù)孢子萌發(fā)、菌絲分化、分生孢子梗和子囊形成等結(jié)果，結(jié)合菌落特征、菌絲形態(tài)及生長狀況，參考《真菌鑒定手冊》與文獻(xiàn)資料描述，初步鑒定分離菌株為子囊菌綱-真子囊菌亞綱-球殼菌目-冠囊菌科-冠散囊菌屬。

圖1 工廠環(huán)境中“冠突散囊菌”和其他真菌菌落Fig.1 Colonies of Eurotium amstelodam and other fungi in the factory environment

圖2 “冠突散囊菌”在察氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d的菌落Fig.2 Colony morphology of Eurotium amstelodam in Czapek’s culture after 5 days incubation

A.冠突散囊菌孢子萌發(fā) Spore germination ofEurotiumcristatum；B.有隔菌絲及子囊果形成前期 The formation of hyphae and ascocarp in early stage ；C.子囊果形成前的菌絲卷曲 Hyphae curling before ascocarp formation；D.曲霉孢子形成 The formation ofAspergillusspore；E.閉囊殼及金黃色孢子 Closed capsule and golden spore；F.閉囊殼破裂釋放孢子 Spores are released by rupture of the capsule

圖3冠突散囊菌生長狀況
Fig.3ThegrowthcycleofEurotiumcristatum

2.2 分子生物學(xué)鑒定

對照測序色譜圖，確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物堿基序列無誤后，用Mega 6.0軟件對26株菌的26S rDNA D1/D2區(qū)序列進(jìn)行多重比對，相似度為100%。系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結(jié)果表明，26株供試菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)序列與登錄號為JN938912.1、U29549.1、JF922030.1和AY213699.1的Eurotiumamstelodami序列聚在同一簇，同源性100%，確定研究中分離得到的菌株為冠突散囊菌(圖4)。

將測序得到的ITS序列多次校對編輯后，使用Mega 6.0軟件，選用PenicilliumrestrictumAY354256.1相應(yīng)序列作為外群(Outgroup)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明26株分離菌的ITS序列與GenBank中登錄號為KC466532.1的Eurotiumamstelodami的ITS序列聚在同簇(圖5)，同源性99%，鑒定分離株為冠突散囊菌。

圖4 26株菌種的26S rDNA的D1/D2區(qū)序列進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree of 26 strains based on D1/D2 region of 26S rDNA

3 討 論

近年來，很多學(xué)者對湖南發(fā)酵茶中的微生物進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果均表明湖南發(fā)酵茶中的主要微生物為冠突散囊菌[14-17]。另有學(xué)者對茯茶中微生物、化學(xué)成分及保健功能研究后，所得結(jié)果并不一致，存在分歧[18-21]。

Mao等[22]、周紹琴[23]和Hong等[24]分別在六堡茶、傳統(tǒng)發(fā)酵豆瓣醬和韓國豆醬中也檢出冠突散囊菌，表明冠突散囊菌不僅存在茯茶之中，還可能在許多對人體健康有益的食品中存在。

在陜西涇陽，人們幾百年來一直通過手工方式自然發(fā)酵生產(chǎn)茯茶，但其規(guī)模都不大，產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊。近年來，隨著市場需求的增加及食品生產(chǎn)規(guī)模化、安全化和標(biāo)準(zhǔn)化的驅(qū)動，涇陽茯茶的生產(chǎn)規(guī)模和質(zhì)量越發(fā)受到當(dāng)?shù)卣匾暋？梢钥隙ǖ氖牵跊荜枺瑥墓诺浇袢藗兡軌蜃匀话l(fā)酵生產(chǎn)茯茶，表明該地區(qū)的環(huán)境中肯定廣泛存在能夠發(fā)酵茶葉生產(chǎn)茯茶的冠突散囊菌。然而，此前并沒有相關(guān)研究揭示該地區(qū)茯茶及茯茶生產(chǎn)環(huán)境中的“金花菌”、流行狀況和多樣性，并對之進(jìn)行分類鑒定。本研究通過對茯茶及茯茶生產(chǎn)環(huán)境中“金花菌”進(jìn)行分離鑒定，明確該地區(qū)茯茶及其生產(chǎn)環(huán)境中的“金花菌”為冠突散囊菌，且在兩個不同廠區(qū)和不同工段的冠突散囊菌屬同一種。

本研究還表明冠突散囊菌在察氏培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上生長狀況略有不同。相對察氏培養(yǎng)基，冠突散囊菌在PDA上更容易生成褐色類物質(zhì)，這可能與培養(yǎng)基成分不同有關(guān)。該菌代謝產(chǎn)生的褐色物質(zhì)及其含量可能與茯茶的湯色深淺間存在一定關(guān)系。

圖5 26株菌的ITS序列進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of 26 strains based on Internal Transcribed Spacer (ITS) sequence