復方紅豆杉膠囊對Walker-256移植性肝癌大鼠HIF-1α、VEGF及PCNA表達的影響*

張 琳,高 勇

陜西省寶雞市婦幼保健院(寶雞 721000)

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，具有治療難度大、發病率高及死亡率高等特點。諸多研究結果表明，中醫藥對于肝癌等各種類型癌癥的治療具有確切的臨床療效[1-2]。復方紅豆杉膠囊是臨床常用的抗腫瘤中藥制劑，具有活血祛瘀、消腫散結等功效，主要用于非小細胞肺癌的輔助治療[3]。有研究結果表明，復方紅豆杉膠囊用于治療肝癌亦具有較好的療效，但該結論仍缺乏動物實驗及大樣本臨床觀察結果予以深入闡述，而對于藥物作用機制亦未進行研究[4]。為此，本研究觀察了復方紅豆杉膠囊對Walker-256移植性肝癌大鼠肝組織中缺氧誘導因子(HIF-1α)、血管內皮生長因子(VEGF)及增殖細胞核抗原(PCNA)等腫瘤缺氧微環境中主要細胞因子表達的影響，期望為復方紅豆杉膠囊用于肝癌的治療提供一定的實驗依據，現報道如下。

材料與方法

1 動 物 清潔級SD雄性大鼠50只，體質量180～220 g，另取清潔級斷奶SD雄性大鼠10只用于肝癌細胞的增殖傳代，體質量60～80 g，每周進行1次傳代，形成癌性腹水后制作腫瘤細胞懸液，用于移植性肝癌造模。所有大鼠均購于陜西省疾控中心實驗動物中心，并由該中心代飼養，動物生產合格證號: SCXK(陜)2017-0002。

2 實驗瘤株 本研究所用Walker-256癌肉瘤，購買自中國典型培養物保藏中心，并保存在陜西省疾控中心藥品評價中心-80℃冰箱。

3 儀器與試劑 Olympus 21型顯微照相系統(日本奧林匹斯公司)；BBS-DC型超凈化工作臺(上海安賽醫療器械有限公司)；AS-SA1型全自動血液分析儀(北京博大醫用器械公司)；5417R型冷凍離心機(德國Eppendorf實驗儀器公司)；NB-9型全自動多功能酶標儀(美國天地公司)。兔抗HIF-1α、VEGF及PCNA抗體及檢測所需試劑盒(南京建成生物制品研究所)；蘇木素-伊紅溶液(美國sigma公司)；PBS磷酸鹽緩沖液(陜西安義生物制品有限公司)；復方紅豆杉膠囊(重慶賽諾生物藥業股份有限公司)。

4 分組、給藥及造模方法 將上述50只清潔級SD雄性大鼠隨機分為空白組、模型組、小劑量復方紅豆杉膠囊處理組、中劑量復方紅豆杉膠囊處理組和大劑量復方紅豆杉膠囊處理組，每組均為10只。依據文獻報道[5]，確定各組大鼠的給藥劑量，即大鼠給藥劑量(mg/kg)=成人劑量(mg/kg)×6.25，成人體質量用60 kg計，復方紅豆杉膠囊的一般人體劑量為1.8 g/60 kg=0.03 g/kg，折合大鼠劑量則為0.03×6.25=0.1875 g/kg，故分別選取0.93 g/kg，0.1875 g/kg及0.37 g/kg為小劑量組、中劑量組及大劑量組的給藥劑量。

根據文獻方法[6]，對各組大鼠進行肝癌模型造模：抽取5 ml二次傳代后的幼鼠癌性腹水，以高速離心機(1200 r /min；5 min)離心后棄去上清液，用生理鹽水洗滌下層瘤細胞1次，洗滌結束后以PBS溶液制備瘤細胞懸液備用。實驗用SD大鼠術前禁食禁水12 h，以40 mg /kg 劑量的2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，麻醉成功后均取仰臥位固定并采用碘酒消毒，沿腹白線自大鼠劍突下逐層切開約1.5 cm，暴露大鼠腹腔并托出肝左外葉，用0.25 ml 注射器抽取瘤細胞懸液0.05 ml(細胞計數約5×106個)，將針頭與肝臟表面呈30°角斜刺入除空白組外其余組大鼠肝左外葉約0.8 cm，將瘤細胞懸液緩慢注入，快速拔針并采用凝膠止血海綿填塞穿刺點15 s，無活動性出血后將肝臟還納于腹腔并縫合腹部傷口，空白組則注入等量生理鹽水，其余操作均與各組一致。術后肌肉注射青霉素[10 萬U/(只·d)]，連續注射3 d。于造模第7天，從各組分別隨機抽取2只大鼠處死并取肝臟，病理組織學檢查結果證實空白組肝臟均正常，而其余組則均成功造模，故本研究各組大鼠有效例數均為8例。于造模第8天開始，對低、中及高劑量組大鼠灌胃給予相應劑量的復方紅豆杉膠囊，采用生理鹽水進行溶解并配制為密度1.30g/ml的浸膏，1次/d，連續給藥21 d，空白組及模型組則僅給予等量生理鹽水。

5 標本處理及檢測方法 于末次給藥24 h后，采用乙醚將大鼠麻醉，以腹主動脈取血法取5 ml血，以高速離心機(1200 r /min；5 min)分離血清，檢測其中肝功能指標水平，主要包括天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、白蛋白(ALB)及丙氨酸氨基轉移酶(ALT)。采取頸椎脫臼法將各組大鼠處死，解剖取肝臟癌組織(存在多個癌結節的取最大)，空白組則取針頭刺入部位肝組織，將其平均分為4部分，用10%甲醛溶液將其中1份固定，并進行脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋及切片處理，采用蘇木精-伊紅染色法進行常規組織學觀察。其余三部分則采用常規脫蠟，以SP法檢測，抗HIF-1α、VEGF及PCNA抗體的工作濃度依次為1∶200、1∶300和1∶500，上述蛋白陽性表達依次為胞質呈黃色顆粒、黃色細胞核染色及胞質呈藍色顆粒，應用Image-proplus 6.0軟件對上述蛋白陽性表達進行半定量分析，并統計其相對表達量。

結果

1 各組大鼠肝功能比較 見表1。與模型組相比較，空白組、小劑量、中劑量和大劑量復方紅豆杉膠囊處理組大鼠血清ALB含量明顯增高，而AST、TBIL及ALT含量則均明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。與空白組相比較，小劑量、中劑量和大劑量復方紅豆杉膠囊處理組大鼠血清ALB含量降低，而AST、TBIL及ALT含量則均明顯增高，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠肝功能比較

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

2 各組大鼠肝臟病理學比較 光鏡下顯示，正常組肝組織結構正常，小葉邊界清晰，被膜無增厚，肝葉實質細胞無壞死及變性，無淋巴細胞浸潤，肝板以小葉中央靜脈為中心放射排列，中央靜脈壁無增厚，未見結締組織增生，間質細胞不增多且門管區三管清晰可見。模型組則出現肝癌細胞呈團塊狀及梁索狀排列并向周圍組織浸潤，區域肝細胞大量非典型性增生，周圍組織肝細胞呈現點狀壞死及彌漫性水腫變形，結締組織明顯增生，肝小葉結構被破壞且匯管區出現大量炎性細胞浸潤。小劑量、中劑量和大劑量復方紅豆杉膠囊處理組大鼠肝癌細胞排列紊亂，結締組織異常增生及胞核腫脹增大等現象較模型組均得到了明顯改善，尤其以高劑量組中最為顯著(圖1)。

A：空白組；B：模型組；C：小劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組

3 各組大鼠肝臟HIF-1α、VEGF及PCNA表達比較 見表2。空白組肝臟中HIF-1α、VEGF及PCNA僅偶見陽性表達細胞，模型組肝臟中上述蛋白均呈強陽性表達，而小劑量、中劑量和大劑量復方紅豆杉膠囊處理組肝臟中HIF-1α、VEGF及PCNA陽性表達細胞數均顯著弱于模型組。Image-proplus 6.0軟件的半定量分析結果表明，與模型組比，空白組、小劑量、中劑量和大劑量復方紅豆杉膠囊處理組大鼠肝臟HIF-1α、VEGF及PCNA的相對表達量均明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與空白組比，小劑量、中劑量和大劑量復方紅豆杉膠囊處理組上述蛋白相對表達量均明顯增高，差異有統計學意義(圖2～4)。

A：空白組；B：模型組；C：小劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組

A：空白組；B：模型組；C：小劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組

A：空白組；B：模型組；C：小劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組

組 別nHIF-1αVEGFPCNA空白組81.00±0.00*1.00±0.00*1.00±0.00*模型組824.56±2.45#35.31±3.56#27.34±2.13#小劑量組818.31±1.87#19.23±1.98#21.33±2.08#中劑量組815.24±1.46*#16.24±1.68*#16.34±1.31*#大劑量組89.21±0.86*#8.45±0.92*#7.31±0.73*#

注：與對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

討論

肝癌的轉移與復發是造成患者死亡的最重要原因之一，以往臨床對于肝癌轉移與復發的研究多集中于腫瘤組織與癌細胞自身，而目前對腫瘤組織與細胞的微環境研究則已發展成為抗腫瘤研究的新方向[7-8]。腫瘤微環境是腫瘤細胞發展、侵襲及轉移的重要場所，而HIF-1α、VEGF及PCNA等細胞因子在上述過程中均扮演著重要角色，上述蛋白可通過復雜的信息傳導通路為腫瘤組織提供適合發展的外部環境，不斷促進腫瘤的侵襲及轉移[9]。其中HIF-1α是人體中唯一的在腫瘤細胞特異性缺氧狀態時發揮活性的一種轉錄因子，可有效促進腫瘤細胞對缺氧微環境的適應作用，參與腫瘤新生血管的生成，并促進癌細胞增殖、浸潤及轉移，在腫瘤的發展過程中起到關鍵作用[10-11]。VEGF則是機體中最重要且最直接的促血管生成因子之一，可直接促進腫瘤新生血管的生成作用，其合成量與HIF-1α水平的變化情況成正比，具有顯著的相關性[12-13]。PCNA則能夠有效促進腫瘤細胞的大量增殖，并參與多種類型腫瘤組織的浸潤與轉移，其表達量可直接反映腫瘤細胞增殖及分化作用，在缺氧狀態下，該蛋白還可有效促進HIF-1α的合成與分泌，間接的促進腫瘤病灶血管生成作用[14-15]。由此可見，通過觀察HIF-1α、VEGF及PCNA等腫瘤微環境細胞因子的變化情況來監測腫瘤病灶的動態，對于癌癥的治療具有重要意義。

復方紅豆杉膠囊是臨床常用于治療非小細胞癌的現代化中藥制劑，主要由紅豆杉、紅參與甘草等多種藥材所組成，具有活血祛瘀、消腫散結等功效，方中紅豆杉可消積、活血祛瘀、消腫散結及解毒；紅參則可扶正固本；甘草調和諸藥[16-17]。現代藥學研究結果表明，復方紅豆杉膠囊中含有的紅豆杉總生物堿可有效阻滯機體HIF-1α的合成與釋放，從而抑制腫瘤的浸潤與侵襲；甘草次酸則可具有較強的保肝活性，可改善肝癌所導致的肝損傷；紅參水提取物則能夠抑制VEGF的合成，從而降低腫瘤新生血管的生成作用[18-20]。目前，臨床對于復方紅豆杉膠囊用于非小細胞癌的治療具有一定的研究基礎，而少數臨床觀察結果亦顯示該藥物治療肝癌亦具有較好的療效，但對于復方紅豆杉膠囊用于肝癌的治療機制與動物實驗研究則涉及較少。鑒于該藥物具有較好的抗肝癌及抗腫瘤微環境細胞因子的物質基礎，筆者采用Walker-256移植性肝癌大鼠模型對復方紅豆杉膠囊抗肝癌活性及其對HIF-1α、VEGF及PCNA等腫瘤微環境細胞因子的表達的影響進行了觀察，期望為該藥物的應用及肝癌的治療藥物選擇提供一定的實驗依據。

綜上所述，復方紅豆杉膠囊可通過降低Walker-256移植性肝癌大鼠模型HIF-1α、VEGF及PCNA的表達，從而達到抑制腫瘤增長、降低癌細胞對肝細胞的損傷的目的，對復方紅豆杉膠囊用于肝癌的治療提供了較好參考價值。