正交試驗法優選益陰消渴滴丸提取工藝*

宋國紅，李 卿，尹小玲

（1.重慶市中藥研究院，重慶 400065； 2.重慶三峽中心醫院，重慶 404000）

益陰消渴原劑型為膠囊劑，功能主治為益氣養陰、清熱生津，用于氣陰不足所致消渴及2型糖尿病見上述證候者。由于原制劑中有效成分葛根素在水中溶解度較差，口服后吸收緩慢，選用的普通膠囊制劑采用部分藥物粉碎后直接入藥的方式，影響其臨床療效的發揮和患者的順應性。本研究中采用先進提取純化技術，提取分離益陰消渴處方中有效成分，提高有效成分含量，采用固體分散技術研制成現代速釋制劑，既能降低血糖，又能改善糖尿病癥狀，減少糖尿病并發癥，保護糖尿病受損靶器官，劑型先進，釋藥速度快，生物利用度高。本研究中采用L9（34）正交試驗設計，以處方中君藥葛根的主要成分葛根素為測評指標，優化益陰消渴方的提取工藝，為其工業化生產提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：LC-2010A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SB-5200D型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；HH-S型水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）；AE240型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

試藥：葛根、野苦瓜、荔枝核、山藥藥材均購自重慶市菜園壩中藥材市場，經重慶市中藥研究院肖銘玉副研究員分別鑒定為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）ohwi的干燥根，葫蘆科植物野苦瓜Momordica charantiaL.的成熟果，無患子科植物荔枝Litchi chinensisSonn.的干燥成熟種子，薯蕷科植物薯蕷Dioscorea oppositeThunb.的干燥根莖；葛根素對照品（中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號為752-200108）；甲醇為色譜純，水為一級水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 葛根素含量測定

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗［1］

色譜柱：Diamonsil C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -水（28 ∶72）；流速：1 mL ／min；柱溫：30 ℃；檢測波長：250 nm。在此條件下的色譜圖見圖1。葛根素色譜峰與相鄰峰分離度良好。

2.1.2 溶液制備

取葛根素對照品18.64 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品貯備溶液。照樣品處方比例，取野苦瓜2.5 g，葛根15.5 g，荔枝核1.0 g，山藥1.0 g，共9份，按正交試驗方案回流提取，濾過，濃縮至適量，用乙醇定容至250 mL，搖勻；精密量取2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲提取（功率為200 W，頻率為50 kHz）15 min，冷至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，取續濾液，即得供試品溶液。照樣品處方比例，稱取缺葛根的其余3味藥材，照供試品溶液制備方法制備缺葛根陰性對照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.3 方法學考察

線性關系考察：分別精密吸取葛根素對照品貯備溶液 0.5，1.0，2.0，4.0，5.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取10 μL，進樣，按擬訂色譜條件測定，以葛根素進樣量（X，g）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝7131295X-34632，r＝0.9999（n＝5）。結果表明，葛根素進樣量在 0.3728 ～3.728 0 g范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取對照品溶液10 μL，在擬訂色譜條件下連續進樣6次，測定。結果的RSD為0.78%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0，1，4，8，16 h時進樣測定，結果峰面積值的RSD為0.94%（n＝6），表明供試品溶液在16 h內較穩定。

重復性試驗：取制備的同一樣品6份，照2.1.2項下供試品溶液制備方法中“精密量取2.0 mL”起，制備供試品溶液，按擬訂色譜條件，測定峰面積，計算含量。結果的RSD為1.06%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一樣品6份，精密加入葛根素對照品適量，照2.1.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定含量，計算回收率。結果見表1。

表1 葛根素加樣回收試驗結果（n＝6）

2.2 提取試驗單因素考察

以乙醇為提取溶劑，采用回流法進行提取，以葛根素的含量為考察指標，設置單因素試驗分別考察料液比、提取時間和提取次數對葛根素的影響。

料液比：按處方比例，稱取5份樣品，分別加入4，6，8，10，12 倍量 65% 乙醇，提取 2 次，每次 60 min，濾過，合并濾液，加乙醇定容至 250 ml，搖勻。照 2.1.2 項下供試品溶液制備方法中“精密量取2.0 mL”起，制備供試品溶液，進樣測定。

提取時間：按處方比例，稱取5份樣品，分別加入10倍量 65% 乙醇，提取 2 次，時間為 30，40，60，70，80 min，濾過，合并濾液，加乙醇定容至250 mL，搖勻。照2.1.2項下供試品溶液制備“精密量取2.0 mL”起，制備供試品溶液，進樣測定。

提取次數：稱取5份樣品，加入10倍量65%乙醇，分別提取 1，2，3，4 次，時間為 60 min，濾過，濾液加乙醇定容至250 mL，搖勻。照2.1.2項下供試品溶液制備“精密量取2.0 mL”起，制備供試品溶液，進樣測定。

試驗結果：隨著料液比的增加，葛根素含量增加，在8倍量時達最大值，再增大提取溶劑用量，含量不再增加。因此提取溶劑的用量以6，8，10倍量作為正交試驗料液比的3個水平；回流提取時間試驗結果表明，試驗前段隨著提取時間的增加，葛根素含量增加，60 min后葛根素含量趨于穩定，故選擇回流50，60，90 min作為正交試驗提取時間的3個水平；提取次數試驗結果表明，葛根素含量在提取2次后維持在相對平穩狀態，故選擇1，2，3次作為正交試驗提取次數的3個水平。

2.3 提取工藝優化

正交試驗：以提取液中的葛根素為考察指標，因素A為乙醇濃度，因素B為溶劑用量，因素C為提取時間，因素D為提取次數，采用L9（34）正交試驗進行試驗。結果見表2和表3。可見，影響提取效果的因素順序為D＞A＞C＞B，以D3A3C3B2組合最佳。因素A與因素D影響較大，因素C與因素B影響較小，故從節能、低成本考慮，生產中采用70%乙醇提取3次，乙醇用量為藥材量的6倍，第1次回流1.5h，第2，3次回流1 h。

2.4 驗證試驗

為驗證優選工藝的合理性，根據擬訂提取方法，稱取野苦瓜20 g，葛根124 g，荔枝核8 g，山藥8 g，共3份，采用70%乙醇提取3次，乙醇用量為藥材量的6倍，第1次回流1.5 h，第2次、第3次回流1 h，濾過，合并濾液，回收乙醇，并用乙醇定容至適量，測得葛根素含量分別為 0.846%，0.851%，0.848%，RSD為 0.30% （n＝3）。表明益陰消渴滴丸新的提取工藝能達到提取要求，符合實際生產需要，提取工藝條件穩定可行。

表2 正交試驗因素水平及結果（n＝9）

表3 方差分析

3 討論

本試驗中通過影響提取效率的單因素考察與正交試驗相結合的方式，優化了益陰消渴方的初步提取工藝，為后續分離純化提供了數據分析基礎。篩選優化工藝參數時，不僅考慮了葛根素的提取率，且充分注重提取方法在工業化大生產中的實際應用，即生產成本，人力、物力消耗，溶劑損耗，提取周期的設置等，節省各項生產中消耗支出，極大地增強了企業的產品競爭力。

參考文獻［2-10］，葛根含多種化學成分，包括黃酮類、三萜類、甾體類、香豆素類，其提取方法有乙醇回流提取法、乙醇超聲提取法、微波法、超臨界提取法、水煎煮提取法等；野苦瓜主要化學成分包括三萜、甾類、生物堿；荔枝核含皂苷；山藥含游離氨基酸，尿囊素，膽堿，麥角甾醇等，以上各藥所含主要有效成分在水和乙醇中均能較好地溶解。前期預試中，對處方中藥材的提取方法進行了初步篩選，結果發現，以葛根素為代表的檢測指標采用水煎煮法進行制備，其含量為0.65%；采用乙醇回流法進行提取，葛根素含量為0.82%。2種提取方法差異明顯，故本研究選用乙醇回流法進行制備工藝優化。

采用正交試驗優化中藥類產品提取工藝時，多采用含量檢測結合浸膏收率的多指標試驗優選工藝參數，由于浸膏收率不但不能突出表明該工藝的優越性，各項影響因素及水平對浸膏收率的影響不盡相同，反而可能阻礙其含量檢測指標對試驗結果的分析和判斷。而本試驗中制備高效富集處方的有效部位群要為下一步純化提供數據基礎，故未選擇浸膏收率作為該優化提取工藝參數的指標。益陰消渴原制劑為部分葛根藥材粉碎入藥，葛根中主要成分葛根素溶出較慢［11-14］，在人體內吸收和利用較差。本試驗中選用乙醇回流提取法進行制備，野苦瓜、葛根等有效成分相當部分都能從藥材中提取，再經大孔樹脂富集、純化，中間固形物收率減少，日服用量降低，利用固體分散技術制成滴丸劑，藥物中有效成分溶出速度加快，生物利用度提高。