尾巨桉樹皮提取物抗氧化活性及其成分分析

石甜甜，李晶晶，* ，林春鳳，程 浩，裴梓廷，農(nóng)福歸，甘金佳，毛玲莉

(1.桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，廣西桂林541004;2.廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所，廣西桂林541006;3.廣西農(nóng)業(yè)科學院桂北分院桂林市農(nóng)業(yè)科學院，廣西桂林541006)

桉樹屬于桃金娘科桉屬的一種喬木，是我國重要的造林樹種之一，在我國的種植面積很大(僅次于巴西和印度，居世界第3位)，桉樹作為人造板和紙漿造紙的優(yōu)良原料，桉葉和樹皮是其加工業(yè)的主要副產(chǎn)品，生物量非常大［1－3］。其化學成分研究集中于枝葉，按照揮發(fā)性可分為揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分兩類，已報道的非揮發(fā)性成分主要有三萜類、黃酮類、鞣質(zhì)、酰基間苯三酚類、酚酸類、甾醇類、脂肪酸等［4］。桉葉成分的生物活性研究主要集中在抗氧化和抗菌活性方面［5］。

近年來國內(nèi)外對桉樹樹皮中活性成分的研究日益活躍。研究表明，桉樹樹皮含有單寧［6－7］、三萜類［8－10］、間苯三酚類、黃酮類、單萜類、酚酸類、甾醇類和脂肪酸類活性物質(zhì)［10－13］，是一種可以重復利用的生物資源。但在中國絕大部分樹皮資源尚未得到利用，而是被廢棄或焚燒，這不但增加了固體廢物處理的環(huán)境負擔，而且造成了樹皮資源的過渡浪費。目前，絕大多數(shù)桉樹樹皮的化學成分還未有研究，已有研究的僅有藍桉、大桉、直桿藍桉、窿緣桉和Eucalyptus urograndis等少數(shù)幾個樹種;針對桉樹樹皮抗氧化活性的研究還不夠深入，主要集中于體外抗氧化活性，缺乏動物體內(nèi)研究及抗氧化作用機制的研究，造成樹皮資源開發(fā)再利用的理論基礎極其缺乏。

尾巨桉(Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis)是廣西目前主要種植的桉樹樹種，目前關(guān)于尾巨桉樹皮的抗氧化活性和化學成分研究未見報道。本文采用總還原力、DPPH清除能力和Fe2+螯合能力三種體外抗氧化模型以及D－半乳糖致衰老動物模型，對尾巨桉樹皮乙醇提取物的抗氧化作用進行研究，并測定其總黃酮、總單寧和總?cè)坪浚云跒殍駱錁淦べY源的開發(fā)再利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

尾巨桉樹皮 尾巨桉自然脫落樹皮和新鮮樹皮均于2016年11月采自廣西柳州鹿寨縣黃冕林場，由廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所姚月鋒副研究員鑒定;實驗動物 雌雄各半4周齡SPF級KM(昆明)小鼠50只(體質(zhì)量18～22 g)，購自于桂林醫(yī)學院動物實驗中心，動物許可證號:SCXK(桂)2013－0001;D－半乳糖 北京索萊寶生物科技有限公司;蘆丁、沒食子酸、熊果酸標準品 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司;SOD、MDA、CAT、GSH－Px和考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒 南京建成生物工程中心;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

FE－130型植物粉碎機 河北黃驊科學儀器廠;EYELA－1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本Tokyo Rikakikai公司;101A－1E型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海實驗儀器有限公司;LUX型多功能性酶標儀、Biomate3S型紫外可見光分光光度儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 尾巨桉樹皮乙醇提取物的制備 分別稱取2 kg尾巨桉自然脫落樹皮和新鮮樹皮于40℃干燥后粉碎過篩(60目)，將植物粉末置于10 L 95%乙醇中室溫下冷浸提取，共提取3次，每次7 d，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮分別得到尾巨桉自然脫落樹皮乙醇提取物浸膏和新鮮樹皮乙醇提取物浸膏，置于4℃冰箱中保存［14］。實驗前取適量浸膏置于蒸發(fā)皿內(nèi)，于60℃鼓風干燥箱中干燥成粉末后粉碎過篩(100目)，用于生物活性與化學成分測定。

1.2.2 體外抗氧化活性測定 準確稱取1.2.1中尾巨桉樹皮乙醇提取物粉末0.0025 g，置于燒杯中，用無水乙醇溶解后移入100 mL容量瓶中，加入無水乙醇至刻度配成25μg/mL的母液。采用對半稀釋法，取25 mL 25μg/mL的溶液移入50 mL容量瓶中，加入無水乙醇至刻度配成12.5μg/mL的溶液。按照上述方法，依次配制 6.25、3.125μg/mL的溶液，得到3.125、6.25、12.5和25μg/mL樣品溶液用于體外抗氧化活性測定。

1.2.2.1 總還原能力測定 分別取上述不同濃度(3.125、6.25、12.5、25 μg/mL)的樣品溶液 0.5 mL，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH6.6 0.2 mol/L)，2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，于50℃水浴中水浴20 min，再分別加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，于室溫下反應10 min。取其中溶液2.5 mL，并加蒸餾水2.5和0.5 mL 0.1%氯化鐵溶液，混合均勻，10 min后于700 nm波長下測定并記錄吸光度值［15］。以相同濃度的VC做陽性對照。

1.2.2.2 DPPH·清除率測定 分別取上述不同濃度(3.125、6.25、12.5、25 μg/mL)的樣品溶液各 2.0 mL，再加6×10－5mol/L DPPH 2.0 mL溶液充分混勻。室溫黑暗放置30 min后，用相應的溶劑(無水乙醇)做參比，在517 nm可見光波長測定吸光值為A樣品。同時，待測樣品溶液2.0 mL與2.0 mL無水乙醇混合液，在517 nm可見光波長測定吸光值為 A對照。向2.0 mL DPPH溶液中加入2.0 mL無水乙醇，記錄吸光值為A空白，作為空白對照［16］。用相同濃度的 VC作陽性對照。

1.2.2.3 亞鐵離子螯合能力的測定 分別在0.1 mL上述的不同濃度(3.125、6.25、12.5、25 μg/mL)樣品溶液中加入0.05 mL FeCl2(2 mmol/L)和0.1 mL菲洛嗪(5 mmol/L)，用無水乙醇將反應體積稀釋到3 mL，混合均勻后在室溫下放置10 min，于562 nm測定吸光值［17］以相同濃度的VC作陽性對照。樣品對菲洛嗪－Fe2+復合物生成的抑制率(%)計算公式如下:

式中，A0為不含待測樣品時FeCl2和菲洛嗪混合液的吸光值;A為加入待測樣品溶液和FeCl2溶液和菲洛嗪混合液的吸光值。

1.2.3 尾巨桉樹皮提取物對D－半乳糖致小鼠衰老的改善作用研究 將適應環(huán)境飼養(yǎng)1周后的KM小鼠隨機分為5組，即正常組、衰老對照組、尾巨桉樹皮提取物低劑量灌胃組、尾巨桉樹皮提取物高劑量灌胃組，維生素C灌胃組(陽性對照組)，每組10只，雌、雄鼠各一半。實驗開始后，小鼠每日腹腔注射一次D－半乳糖(120 mg/kg)，正常組注射等體積的生理鹽水，造模時間為4周，每周稱重一次，依據(jù)末次稱重的克數(shù)調(diào)整給藥劑量。第四周末，分別選取正常組和衰老模型組小鼠(備用)各10只，摘眼球采血，分離血清，測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)含量，以驗證小鼠衰老情況，衰老模型組小鼠指標與正常組相比具有統(tǒng)計學意義，表示造模成功。

第5周開始，正常組除每日繼續(xù)注射等體積的生理鹽水外每日灌胃0.2 mL蒸餾水，衰老對照組除每日腹腔注射一次D－半乳糖(120 mg/kg)外每日灌胃0.2 mL蒸餾水，尾巨桉樹皮提取物低劑量灌胃組、尾巨桉樹皮提取物高劑量灌胃組和維生素C灌胃組除每日繼續(xù)腹腔注射一次D－半乳糖(120 mg/kg)外，每日分別灌胃尾巨桉樹皮提取物粉末(20和100 mg/kg)及維生素C(100 mg/kg)，持續(xù)4周，每周記錄小鼠體質(zhì)量，然后對所有小鼠禁食24 h后，眼球取血，斷頸處死后取肝臟和腎臟進行后續(xù)實驗［18］。

1.2.4 血清、肝臟和腎臟組織中SOD、CAT和GSH－Px酶活性及MDA水平測定 小鼠血漿靜置1 h后離心分離(4 ℃，3500 r/min，15 min)，然后取上層血清，按試劑盒說明書測定小鼠血清中的SOD、CAT、GSH－Px活性及MDA水平。分別將小鼠肝臟和腎臟制成10%的勻漿液后(4℃，3500 r/min，15 min)離心，取上清液按試劑盒說明書測定SOD、CAT、GSH－Px和MDA的活性。

1.2.5 尾巨桉樹皮黃酮含量的測定 按照參考文獻［19］的方法，稱取真空干燥(60℃、5 h)至恒重的蘆丁標準品20 mg，用無水乙醇溶解后定容至100 mL容量瓶中，配成200μg/mL的蘆丁標準液。準確吸取蘆丁標準液0、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3 mL 移入比色管中，分別加入無水乙醇至7.5 mL，依次加入0.5 mL(100 g/L)硝酸鋁溶液，0.5 mL(9.8 g/L)醋酸鉀溶液搖勻，加蒸餾水至16.5 mL，搖勻，靜置1 h，以零管為空白，于波長為415 nm測定吸光度。以蘆丁含量(μg)為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

準確稱取尾巨桉樹皮的乙醇提取物粉末0.05 g，置于燒杯中，用無水乙醇溶解后移入50 mL容量瓶中，加入無水乙醇至刻度混勻備用。吸取一定濃度(1.0 mg/mL)的待測樣品溶液0.5 mL，移入比色管中，重復標準曲線制作步驟，于415 nm測定樣品溶液的吸光度值。

式中:W－樣品中黃酮的質(zhì)量分數(shù)(%);C－從標準曲線中查得樣品測定液中黃酮的含量(μg);V1－樣品測定液總體積(mL);m－尾巨桉樹皮乙醇提取物的質(zhì)量(g);V2－測定時所取的樣品測定液體積(mL)。

1.2.6 尾巨桉樹皮單寧含量的測定 分別吸取0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L 的沒食子酸標準使用液各1.0 mL，分別加入5.0 mL蒸餾水，1.0 mL鎢酸鈉－鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL碳酸鈉溶液，混勻，放置2 h，以標準曲線0.0 mg/L為空白，在765 nm波長下測定標準溶液的吸光度，以沒食子酸含量(mg)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線［7，20］。

吸取1.2.5中配制的1.0 mg/mL的待測樣品溶液1.0 mL，按照標準曲線制作步驟，在765 nm波長下測定樣品溶液的吸光度，根據(jù)標準曲線及公式計算待測樣品液單寧含量。

式中:W－樣品中單寧質(zhì)量分數(shù)(%);V－容量瓶的體積(mL);C－從標準曲線中查的樣品測定液中所含單寧含量(mg);V1－樣品測定液的總體積(mL);V2－測定時所取樣品測定液的體積(mL);m－尾巨桉樹皮乙醇提取物的質(zhì)量(g)。

1.2.7 尾巨桉樹皮三萜含量的測定 分別吸取熊果酸標準溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL(相當于熊果酸0～58.5μg)，置于10 mL比色管中，于60℃水浴蒸干，加入0.4 mL 5%香草醛－冰醋酸，混勻，加1.0 mL高氯酸，混勻，在60℃水浴中加熱15 min后移入冰浴中冷卻，并加入冰醋酸5 mL，混勻后置于室溫下，在30 min內(nèi)，于548 nm處測定并記錄吸光度值，以熊果酸質(zhì)量(μg)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

準確稱取樹皮的乙醇提取物粉末0.05 g，置于50 mL容量瓶中，加入約30 mL氯仿，置于超聲提取器中(1200 W)超聲波提取30 min，取出冷卻至室溫，并加氯仿至刻度，搖勻，取上清液0.5 mL置于10 mL比色管中，于60℃水浴蒸干，按照標準曲線制作步驟，在548 nm波長下測定樣品溶液的吸光度［21］，根據(jù)標準曲線及公式計算待測樣品液三萜含量。

式中:W－樣品中三萜的質(zhì)量分數(shù)(%);C－從標準曲線中查得樣品測定液中總?cè)频暮?μg);V1－樣品測定液總體積(mL);m－尾巨桉樹皮乙醇提取物的質(zhì)量(g);V2－測定時所取的樣品測定液體積(mL)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品和每只小鼠的血清和組織測定實驗進行三次平行實驗后取平均值，采用Excel 2010和SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。測定結(jié)果均以“平均值±標準差”表示。采用one－way ANOVA方法進行差異分析，以p＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 尾巨桉樹皮提取物的抗氧化活性分析

2.1.1 尾巨桉樹皮提取物的還原能力分析 尾巨桉樹皮乙醇提取物的總還原力如圖1所示，在所測定的濃度范圍內(nèi)，尾巨桉自然脫落樹皮乙醇提物和尾巨桉新鮮樹皮乙醇提取物還原力均隨測試濃度的增大而增強。同時，在所有測試濃度下，尾巨桉自然脫落樹皮乙醇提物的還原力都顯著(p＜0.05)高于對照藥劑維生素C和尾巨桉新鮮樹皮乙醇提取物的還原力。

圖1 尾巨桉樹皮提取物的還原力Fig.1 Reducing power of E.urophylla×E.grandis bark extracts注:同濃度不同小寫字母表示差異顯著(p＜0.05);圖2、圖3同。

2.1.2 尾巨桉樹皮提取物的DPPH清除能力分析由圖2可見，在3.125～25μg/mL范圍內(nèi)，尾巨桉自然脫落樹皮乙醇提取物清除DPPH·的效果具有明顯的劑量－效應關(guān)系，且清除效果顯著高于對照藥劑維生素C(p＜0.05)。在3.125～25μg/mL范圍內(nèi)，尾巨桉新鮮樹皮乙醇提取物清除DPPH·的效果具有明顯的劑量－效應關(guān)系，當濃度達到25μg/mL時，尾巨桉新鮮樹皮乙醇提取物對DPPH·的清除率到達91.34%，顯著高于同一濃度下尾巨桉自然脫落樹皮乙醇提取物的清除率(86.21%)與維生素 C的清除率(71.46%)(p＜0.05)。

圖2 尾巨桉樹皮提取物的DPPH·清除率Fig.2 Metal scavenging DPPH effects of E.urophylla×E.grandis bark extracts

2.1.3 尾巨桉樹皮提取物的Fe2+螯合能力分析 一些金屬離子，如鐵離子、銅離子在脂質(zhì)的氧化過程中起催化作用，因此具有金屬螯合作用的物質(zhì)可以間接地起到抗氧化的作用。從圖3可以看出，在3.125～25μg/mL范圍內(nèi)，尾巨桉自然脫落樹皮乙醇提物和尾巨桉新鮮樹皮乙醇提取物的金屬螯合能力均隨著濃度的增加而平緩增加，在濃度25μg/mL時，兩者對亞鐵離子的螯合率均達到最大，分別為28.86%和21.43%，但均低于對照藥劑維生素C(30.01%)。由圖1～圖3可以看出，尾巨桉自然脫落樹皮乙醇提取物的體外抗氧化活性比新鮮樹皮乙醇提取物的活性強，因此，選擇尾巨桉自然脫落樹皮乙醇提取物進一步測定其對D－半乳糖致衰老模型小鼠的抗氧化作用。

圖3 尾巨桉樹皮提取物的亞鐵離子螯合能力Fig.3 Chelating effects of E.urophylla×E.grandis bark extracts

2.2 尾巨桉自然脫落樹皮提取物對小鼠MDA水平與 SOD、CAT、GSH－Px酶活性的影響

2.2.1 樹皮提取物對小鼠血清中MDA水平與SOD、CAT、GSH－Px酶活性的影響 由表1可知，與衰老對照組小鼠相比，尾巨桉自然脫落樹皮乙醇提取物處理組小鼠血清中SOD、CAT及GSH－Px酶活力顯著升高(p＜0.05)，而血清中 MDA含量顯著降低(p＜0.05)，表明灌胃20和100 mg/kg尾巨桉自然脫落樹皮乙醇提取物能夠明顯改善D－半乳糖致衰老模型小鼠機體的抗氧化能力，同時，能夠明顯改善D－半乳糖對機體造成的氧化損傷。此外，尾巨桉自然脫落樹皮乙醇提取物高濃度灌胃組(100 mg/kg)對衰老小鼠血清中SOD、GSH－Px酶活力的提升效果以及對MDA含量的降低效果優(yōu)于同濃度的維生素C灌胃組(p＜0.05)。

表3 小鼠腎臟中MDA水平與SOD、CAT、GSH－Px酶活性(n=10)Table 3 Levels of MDA and the enzyme activities of SOD、CAT、GSH－Px in kidney of D－galactose induced aging mice(n=10)

2.2.2 樹皮提取物對小鼠肝臟中MDA水平與SOD、CAT、GSH－Px、GSH酶活性的影響 表2中數(shù)據(jù)顯示，與衰老對照組小鼠相比，尾巨桉自然脫落樹皮乙醇提取物高濃度灌胃組(100 mg/kg)小鼠肝臟中

表1 小鼠血清中MDA水平與SOD、CAT、GSH－Px酶活性(n=10)Table 1 Levels of MDA and the enzyme activities of SOD、CAT、GSH－Px in blood of D－galactose induced aging mice(n=10)

注:#表示與正常組相比差異顯著(p＜0.05);*表示尾巨桉灌胃組與衰老對照組相比差異顯著(p＜0.05);▲表示尾巨桉灌胃組與維生素C灌胃組相比差異顯著(p＜0.05)，表2、表3同。SOD酶活力顯著升高(p＜0.05)，且改善效果優(yōu)于同濃度下的維生素C灌胃組(p＜0.05)。而與衰老對照組相比，尾巨桉自然脫落樹皮乙醇提取物對小鼠肝臟中CAT、GSH－Px酶活力雖有一定提高，MDA含量也有一定降低，但均無顯著性差異(p＞0.05)。

表2 小鼠肝臟中MDA水平與SOD、CAT、GSH－Px酶活性(n=10)Table 2 Levels of MDA and the enzyme activities of SOD、CAT、GSH－Px in liver of D－galactose induced aging mice(n=10)

2.2.3 樹皮提取物對小鼠腎臟中MDA水平與SOD、CAT、GSH－Px、GSH酶活性的影響 由表3可知，與衰老對照組小鼠相比，尾巨桉自然脫落樹皮乙醇提取物低濃度處理組(20 mg/kg)小鼠腎臟組織中SOD酶活力顯著升高(p＜0.05)，MDA含量顯著降低(p＜0.05);尾巨桉自然脫落樹皮乙醇提取物高濃度處理組(100 mg/kg)小鼠腎臟中SOD、CAT及GSH－Px酶活力顯著升高(p＜0.05)，而 MDA含量顯著降低(p＜0.05)，表明灌胃尾巨桉自然脫落樹皮乙醇提取物能夠明顯改善D－半乳糖致衰老模型小鼠腎臟的抗氧化能力，同時明顯改善D－半乳糖對機體腎臟組織造成的氧化損傷。此外，尾巨桉高濃度灌胃組對衰老小鼠腎臟中SOD、CAT及GSH－Px酶活力的提升效果優(yōu)于同濃度的維生素C灌胃組(p＜0.05)。

2.3 尾巨桉樹皮中抗氧化物質(zhì)含量分析

尾巨桉自然脫落樹皮和新鮮樹皮中總黃酮、總單寧及總?cè)坪咳鐖D4所示。以蘆丁含量為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線為 Y=0.0015X+0.0019(R2=0.9999);以不同濃度的沒食子酸作為參比標準，繪制標準曲線為Y=7.7086X+0.0024(R2=0.9993);通過不同濃度熊果酸標準液的吸光度值，繪制標準曲線為Y=0.0038X+0.0009(R2=0.9998)。經(jīng)過計算得出尾巨桉自然脫落樹皮中總黃酮和總?cè)坪烤哂谛迈r樹皮，其黃酮和三萜含量分別為6.41%和11.70%，而尾巨桉新鮮樹皮中總單寧含量高于自然脫落樹皮，達到6.49%。

圖4 尾巨桉樹皮中總黃酮、總單寧和總?cè)坪縁ig.4 Contents of total flavonoids，tannins and triterpenoids of E.urophylla×E.grandis bark

3 結(jié)論

本研究通過體外和體內(nèi)實驗來檢測尾巨桉樹皮乙醇提取物的抗衰老作用。實驗結(jié)果顯示，尾巨桉自然脫落樹皮和新鮮樹皮乙醇提取物都具有較強的還原力，能清除DPPH·自由基，還具有一定的Fe2+螯合能力。動物實驗結(jié)果表明，尾巨桉自然脫落樹皮乙醇提取物能夠提高D－半乳糖致衰老小鼠的SOD活力和降低MDA水平;同時，高劑量(100 mg/L)尾巨桉樹皮提取物還能提高衰老小鼠體內(nèi)血清、肝和腎組織中的CAT和GSH－Px的酶活力。成分分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尾巨桉自然脫落樹皮和新鮮樹皮中均含有黃酮、單寧和三萜類化合物，尤其是單寧和三萜類化合物含量豐富。以上的實驗結(jié)果證明尾巨桉樹皮乙醇提取物具有良好的改善衰老作用，且效果優(yōu)于同濃度的維生素C;尾巨桉樹皮中富含黃酮、單寧和三萜類化合物，其具體的活性成分值得進一步研究探索。本研究的結(jié)果將為進一步分離純化尾巨桉樹皮中的抗氧化活性物質(zhì)，以及為尾巨桉樹皮抗衰老藥物和功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。