羥自由基氧化體系對大黃魚肌原纖維蛋白結構的影響

雷葉斯，楊巨鵬，呂春霞，陳世達，張慧恩，楊 華

(浙江萬里學院，浙江寧波315100)

大黃魚(Pseudosciaena crocea)，又稱石首魚，是中國近海主要的經濟魚類之一［1］，在我國海洋漁業中占有重要的地位［2］。我國大黃魚養殖產量占世界養殖總產量的70%以上，我國也是唯一一個大黃魚養殖量超過捕撈量的國家［3］。但是中國的水產品加工率只有30%，而發達國家已經超過了80%［4］。因此魚類的深加工有著巨大的發展前景。目前我國已經研究出多種大黃魚干制方法，近年來也開發了一些休閑小零食產品，但仍有很大一部分大黃魚積壓、養殖戶虧損等現象，因此研究開發大黃魚加工產品具有重要意義［5－6］。

脂質氧化、微生物和酶的作用是食物腐敗變質的主要原因，而蛋白質氧化所引起的食物品質劣變的研究較少［7］。研究發現，蛋白質氧化對肉品的肉色、嫩度有很大的影響［8］。蛋白質氧化是指蛋白質分子在活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的直接作用下，或者是通過氫過氧化物和活性醛類等次生氧化產物但不直接作用于蛋白質，引起的蛋白質空間方面和功能性質的變化［9］。羥基自由基氧化體系主要由抗壞血酸鈉、過氧化氫(H2O2)和三氯化鐵(FeCl3)發生氧化還原反應產生自由基。Park等［10］研究了模擬氧化體系對豬肌原纖維蛋白質的影響，發現其蛋白質羰基含量、硫代巴比妥酸含量及Ca2+－ATPase活性發生改變。李學鵬等［11］研究了模擬氧化體系對六線魚蛋白質的影響，認為·OH會對其魚肉蛋白質的羰基、總巰基、游離氨基酸含量產生影響。Xiong等［12］發現在豬腹部肌肉中羥自由基攻擊肌球蛋白的頭部和尾部。

本實驗采用羥自由基氧化體系，研究養殖大黃魚肌原纖維蛋白的羰基含量、表面疏水性、活性疏基含量、溶解度、SDS－PAGE凝膠電泳和持水性的變化，探索羥自由基氧化對養殖大黃魚肌原纖維蛋白的影響，以期為控制養殖大黃魚貯存和加工過程中魚肉品質發生變化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮養殖大黃魚(0.5～1.0 kg) 寧波市水產市場;抗壞血酸、鹽酸胍、2，4－二硝基苯肼(DNPH)、甘氨酸、三氧化鐵、過氧化氫、BHT、磷酸緩沖液、乙酸乙酯、乙醇、溴酚藍、三氯乙酸 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司;三羥甲基氨基甲烷、2－硝基苯甲酸試劑、雙縮脲試劑、十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳標準蛋白(12～120 kDa) 北京索萊寶有限公司。

FC型酶標儀 賽默飛世爾儀器有限公司;uv2000紫外分光儀 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;Gene Navigator電泳儀 美國 Amershaw公司;FSH－2A高速勻漿機 上海維城儀器有限公司;J－26XP高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特;F－80高速粉碎機 姜堰市新康醫療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大黃魚肌原纖維蛋白的提取 參照李艷青［13］的方法提取養殖大黃魚肌原纖維蛋白。將魚肉用攪拌機攪碎，加入4倍魚肉體積的20 mmol/L冰磷酸緩沖液(pH7.0)進行2次均質，每次時間為30 s，時間間隔為30 s，4℃條件下離心10 min(7300 r/min)，除去上清液。用4倍體積冰洗液(0.1 mol/L NaCl溶液)清洗，重復清洗2次，最后用醫用脫脂紗布過濾后離心10 min(7000 r/min，4℃)，得到的沉淀為養殖大黃魚肌原纖維蛋白，用雙縮脲試劑盒測定蛋白含量，稱重后置于4℃下密閉瓶中保存。

1.2.2 羥自由基氧化體系模擬強氧化過程 參照Oliver等［14］的方法，采用·OH 產生氧化系統，即產生一種活性氧就是羥自由基，它主要是由鐵的氧化還原反應而產生的，系統采用的是三氧化鐵、抗壞血酸鈉和過氧化氫。保持三氯化鐵濃度為0.1 mmol/L，抗壞血酸濃度為0.1 mmol/L，使 H2O2濃度分別為0、0.1、1、5、10、20 mmol/L。

將提取到的肌原纖維蛋白用50 mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)溶解，使其質量濃度為20 mg/mL。然后將蛋白液和氧化體系以2∶1的體積比混合，將混合液于4℃下避光分別氧化1、3、5 h，目的是使魚的肌原纖維蛋白發生不同程度的氧化。最后添加BHT(使其最終含量為0.02%)使反應終止。氧化最后的產物用磷酸緩沖液(pH6.0)進行洗滌，然后在8000 r/min下離心5 min，棄上清，分裝，于－80℃保存待用［15］。

1.2.3 羰基含量的測定 參考Oliver等［14］測定肌原纖維蛋白中羰基的方法，稍做調整。取1.2.1中提取的肌原纖維蛋白，溶于50 mmol/L磷酸緩沖液(p H6.0)中，調整濃度為2 mg/mL，取1 mL于離心管中，再加入10 mmol/L 2，4－二硝基苯肼溶液1 mL，靜置1 h，加入1 mL 20%的三氯乙酸，離心 5 min(10000 r/min)，去上清液，用1 mL乙酸乙酯－乙醇(體積比1∶1)清洗沉淀3次，再加入6 mol/L鹽酸胍溶液3 mL，37℃下水浴15 min，除去不溶物。取上清液離心3 min(10000 r/min)，所得到的溶液在370 nm 下測得吸光度［12］。

1.2.4 表面疏水性的測定 參照Chelh等［16］的方法。配制5 mg/mL的蛋白溶液。取1 mL蛋白溶液于離心管中，加入1 mg/mL溴酚藍200μL。離心15 min(6000 r/min)，將上清液稀釋10倍后于595 nm下測定吸光度A。空白組為不加蛋白的溶液。表面疏水性的計算公式為:

1.2.5 活性巰基含量的測定 參照李艷青等［17］的方法。取濃度為2%的蛋白溶液1 mL加入Tris－甘氨酸溶液8 mL，接著均質和離心15 min(10000 r/min)，除去不溶性的蛋白。取4.5 mL上清液和0.5 mL Ellman試劑進行反應，30 min后分別測定在540、412 nm波長處的吸光度。未氧化的蛋白溶液為對照組，其中有4.5 mL Tris－甘氨酸和0.5 mL Ellman試劑。

活性巰基含量(μmol·g－1MPI)=73.53 × (A412nm－1.6934×A540nm+0.009923) 式(2)1.2.6 溶解度的測定 參照Santelhoutellier等［18］的方法并做適當修改。稱取養殖大黃魚樣品0.5 g，溶解在9 mL 0.6 mol/L氯化鉀溶液中，混合勻漿30 s，4℃下離心10 min(7500 r/min)。取5 mL上清液，在4℃下加入500 g/L三氯乙酸中，使得蛋白溶液體積分數為10%。10%的三氯乙酸清洗沉淀物，用0.5 mol/L氯化鈉溶液溶解。雙縮脲試劑盒測定蛋白含量。按下面的公式(3)計算蛋白中的溶解度。

1.2.7 SDS－PAGE凝膠電泳 參考李學鵬等［15］的方法并做適當修改。配制蛋白溶液使濃度為1 mg/mL，用振蕩儀將蛋白混合1 min，在100℃下水浴3 min。開始電泳時電流為80 V，等到溴酚藍到達濃縮膠和分離膠的界面時，電壓調到120 V;當溴酚藍遷移到凝膠的最下面接近1 cm時，關閉電泳儀;取出后的凝膠用考馬斯亮藍染色2 h，并用甲醇－冰醋酸脫色液脫色，不斷更換脫色液，直至呈現清晰的條帶為止。

1.2.8 持水性的測定 參考李強［19］的方法并做了適當修改。準確稱取0.5 g蛋白樣品于離心管中，用玻璃棒把蛋白攪拌均勻，緩慢加水進去直到樣品黏糊;然后在3000 r/min下離心10 min，棄上清，稱重;根據離心前后的離心管的重量對蛋白質的持水性進行計算，計算公式為:

1.3 數據統計分析

本實驗采用Excel及SPSS進行數據統計分析，重復3次實驗。

2 結果與分析

2.1 養殖大黃魚肌原纖維蛋白羰基含量的變化

羰基的形成是蛋白質氧化后最明顯的變化之一［10］。有4種途徑產生羰基:氨基酸側鏈直接被氧化;肽主鏈斷裂;與還原糖發生反應;結合非蛋白羰基化合物［10］。側鏈上帶有NH－或NH2－的氨基酸會被羥自由基攻擊，被轉化成NH3和相應的羰基衍生物［15］。由圖1可知，經過H2O2處理的羰基含量均比未處理前顯著升高(p＜0.05)。在相同的氧化時間下，羰基的含量會隨著H2O2濃度的升高呈升高趨勢;氧化時間1、3 h時，羰基含量隨濃度是先增加后降低再增加的趨勢，氧化時間為5 h時，羰基含量呈增加趨勢;0～1 mmol/L H2O2處理時，羰基含量呈不斷升高趨勢，這說明，H2O2濃度對蛋白質的氧化程度有較大影響。

圖1 自由基氧化體系對養殖大黃魚MPI羰基含量的影響Fig.1 Effect of free radical oxidation system on carbonyl content of MPI in cultured Pseudosciaena crocea注:不同小寫字母表示具有顯著性差異(p＜0.05);圖2～圖4，圖6 同。

由此可知，經過羥自由基氧化體系氧化后，羰基含量有一定程度的增加。這和Park等［10］研究的豬肉MPI所得出的結果是一致的，Park指出在高濃度的三氧化鐵體系中，蛋白羰基含量在改變過氧化氫濃度以后會發生明顯的增長。

2.2 養殖大黃魚肌原纖維蛋白活性巰基含量的變化

一般而言，蛋白質氧化會使巰基變成二硫鍵，活性巰基含量可以作為蛋白氧化的重要指標之一［16］。Lund等［20］提出，蛋白氧化的程度在一定范圍內可以用巰基含量的下降來表示。Dean等［21］也指出，巰基變成二硫鍵是最初期的氧化反應產物，二硫鍵的形成會導致蛋白結構表面巰基含量的下降，也可能是進一步的被氧化成磺酸類或者是其他氧化產物而導致的［18］。由圖2可知，大黃魚肌原蛋白的活性巰基含量在不同的氧化時間和不同的H2O2濃度下有明顯的不同。在0～5 mmol/L濃度范圍內，H2O2濃度不變時，隨著氧化時間的延長，巰基含量降低，在5 mmol/L濃度下，氧化時間不同時，1 h氧化時間的活性巰基含量最高為7.05μmol/g MPI，3 h氧化時間的活性巰基含量次之，為5.41μmol/g MPI，5 h氧化時間的活性巰基含量最低，為4.80μmol/g MPI。氧化時間不變(1 h)時，隨著H2O2濃度的增加，活性巰基含量呈降低趨勢。在H2O2濃度為20 mmol/L時，活性巰基含量幾乎不隨時間的增加而增大?？赡艿脑蚴?，巰基在高濃度的自由基氧化下，形成了多種氧化產物，如次磺酸基等，隨著氧化的加劇，蛋白質斷裂成一些小分子硫化物［17］。

圖2 自由基氧化體系對養殖大黃魚MPI活性巰基含量的影響Fig.2 Effect of free radical oxidation system on the active thiol content of MPI in cultured Pseudosciaena crocea

2.3 養殖大黃魚肌原纖維蛋白表面疏水性的變化

蛋白的表面疏水性是用來衡量蛋白變性程度的，它能夠反應蛋白位點在化學上或物理上的微妙變化，同時可以體現出蛋白表面疏水性氨基酸的相對含量［12］。表面疏水性在蛋白結構研究中是一個普遍的指標。一般認為，由于氧化使得埋藏在蛋白天然構像內部的疏水性氨基酸殘基暴露出來，從而提高了蛋白表面的疏水性。

由圖3可知，在相同的氧化時間下，蛋白的表面疏水性隨著H2O2濃度的升高呈升高趨勢，氧化時間1 h時，0 mmol/L H2O2濃度的大黃魚肌原纖維蛋白的溴酚結合量最低，為43.46μg，20 mmol/L H2O2濃度的蛋白的溴酚藍結合量最高，為47.33μg。而在相同H2O2濃度下，蛋白的表面疏水性隨著氧化時間的增加呈升高趨勢，在5 mmol/L H2O2濃度下，經過1 h的氧化表面疏水性最低，5 h氧化的表面疏水性最高。短時間的氧化使肌原纖維蛋白質發生較低的變性程度，分子結構變化不大、暴露少量的疏水基團，表面疏水性低;經過較長氧化以后，肌原纖維蛋白的結構會遭到破壞，暴露出分子內部的基團，增加蛋白的表面疏水性［12，17］。

圖3 自由基氧化體系對養殖大黃魚MPI表面疏水性的影響Fig.3 Effect of free radical oxidation system on surface hydrophobicity of MPI in cultured Pseudosciaena crocea

2.4 養殖大黃魚肌原纖維蛋白溶解度的變化

影響蛋白質溶解度的因素分為內部和外部兩種。內部主要是氨基酸組成、分子結構性;外部主要是溫度、p H、離子種類、其他食品成分等［14］。蛋白質－蛋白質和蛋白質－水之間相互作用會影響蛋白質的溶解度［12］。由圖4可以看出，氧化時間為1、3 h時，經H2O2處理后，溶解度明顯呈下降趨勢。在5 h時，其溶解度呈先上升后下降的趨勢，在濃度達到5 mol/L時，其溶解度為42.52%，之后又開始下降。蛋白溶解度降低程度是和氧化程度是正相關的，氧化會引起蛋白的交聯反應，使蛋白發生聚集和沉淀，導致溶解度降低，不同過氧化氫濃度和氧化時間使蛋白質的溶解度不同是由于其引起蛋白質聚集程度不同。

圖4 自由基氧化體系對養殖大黃魚MPI溶解度的影響Fig.4 Effect of free radical oxidation system on solubility of MPI in cultured Pseudosciaena crocea

2.5 SDS－PAGE凝膠電泳

肌原纖維蛋白在經過不同羥自由基濃度氧化后，分子量發生變化的情況可以通過SDS－PAGE凝膠電泳表現出來［19］。由圖5可知，條帶的顏色有些淺，這可能因為是蛋白濃度較小。40～20 kDa之間的條帶肌動蛋白和原肌球蛋白條帶強度明顯增強。結合其他文獻，在較高的氧化條件下，蛋白質可能發生交聯，產生高分子量化合物，也可能是蛋白質聚集體的形成［14］。高分子質量聚集體的形成原因可能是由于半胱氨酸中巰基氧化形成分子間二硫鍵，也可能是因為蛋白質自由基之間發生聚集等原因［12］。由此可以推斷出，蛋白質氧化使其空間結構發生了改變［18］。

圖5 3 h氧化養殖大黃魚肌原纖維蛋白SDS－PAGE電泳圖譜Fig.5 SDS－PAGE electrophoresis of MPI of cultured Pseudosciaena croceafter 3 h oxidation注:1:Marker;2:5 h 20 mmol/L H2 O2處理后的MPI;3:5 h 10 mmol/L H2 O2處理后的MPI;4:5 h 5 mmol/L H2 O2處理后的MPI;5:1 h 10 mmol/L H2 O2處理后的MPI;6:未經過氧化的處理后的MPI。

2.6 養殖大黃魚肌原纖維蛋白持水性的變化

水分子可與蛋白質的一些基團結合，包括主肽鏈基團、帶電基團、Asn和 Gln的酰胺基、Ser、Thr和Tyr殘基的羥基和非極性殘基。蛋白質的持水性和蛋白質的氨基酸組成時存在有關聯的，水合能力與帶電的氨基酸數目呈正比［21］。查閱相關文獻［5］可知，隨著氧化的延長，蛋白質的水合能力大幅度下降。從圖6中可知，氧化時間為5 h時，隨著H2O2濃度的增加，蛋白持水能力在下降。一方面，在氧化過程中，蛋白帶電基團的減少會使得蛋白質等電點向中性靠近，與水結合能力下降;另一方面，蛋白質結合水的能力下降是因為蛋白質－蛋白質之間相互作用增強的關系，也就是蛋白質變性由于氧化的關系［22－23］。

圖6 自由基氧化體系對養殖大黃魚MPI持水性的影響Fig.6 Effects of free radical oxidation system on water holding capacity of MPI in cultured Pseudosciaena crocea

3 結論

利用羥自由基氧化體系對養殖大黃魚肌原纖維蛋白進行氧化，發現肌原纖維蛋白在羥自由基氧化體系中發生了明顯的交聯和聚集現象。羥自由基氧化體系能造成肌原纖維蛋白羰基含量升高，且在相同的氧化時間下，隨著自由基濃度升高，羰基含量呈升高趨勢。SDS－PAGE凝膠電泳分析發現，氧化時間越久，氧化濃度越高，蛋白的電泳蛋白條越暗。經過自由基氧化發現，氧化時間不變(1 h)時，隨著自由基濃度升高，肌原纖維蛋白的巰基含量總體呈下降趨勢，而表面疏水性略有升高，故氧化能夠導致蛋白的聚集或斷裂。本文通過羥自由基氧化體系模擬強氧化環境，研究其對肌原纖維蛋白的影響，以便為養殖大黃魚的貯藏和加工中發生氧化提供理論依據，進而更好的控制氧化的發生，減少魚肉品質的劣變。