不同分子量的葡聚糖 花生分離蛋白接枝復(fù)合物的制備及其性質(zhì)

吳周山，李 晨，* ，薛 瑞，梁 忠，薛 峰，陸利霞，3，熊曉輝，3

(1.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京211800;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023;3.江蘇省食品安全快速檢測公共技術(shù)服務(wù)中心，江蘇南京210009)

花生蛋白是一種營養(yǎng)價值較高的植物蛋白，由其制備的花生蛋白乳飲料不僅含有豐富的營養(yǎng)，而且具有很好的口感，深受消費(fèi)者的喜愛。但由于花生蛋白自身的一些功能性質(zhì)如乳化性、乳化穩(wěn)定性等存在缺陷，導(dǎo)致其制備成的植物蛋白乳飲料不穩(wěn)定，容易產(chǎn)生沉淀物質(zhì)［1］。因此，研究花生蛋白的理化性質(zhì)，對于改善其功能性質(zhì)，開發(fā)新的應(yīng)用方式有著非常重要的意義。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)利用多糖接枝能夠改善蛋白質(zhì)的功能特性，且由經(jīng)過多糖接枝后生成的蛋白－多糖共價聚合物制備成的乳濁液體系能夠保持良好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性［2］。Cai等［3］利用多糖(卡拉膠、殼聚糖、羥甲基纖維素、甲基纖維)接枝到花生蛋白上，并觀察接枝后產(chǎn)物的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)隨著多糖含量的增加，花生蛋白的溶解性降低，而乳化穩(wěn)定性會得到增強(qiáng)。同樣在大豆蛋白和燕麥蛋白與多糖的接枝反應(yīng)中也能得到同樣的結(jié)論［4－7］。多糖接枝是將多糖分子上的還原末端羰基接枝到蛋白質(zhì)分子上的ε－氨基上的反應(yīng)［8］，因此，多糖接枝后形成的蛋白－多糖共價聚合物的性質(zhì)不僅與蛋白質(zhì)有關(guān)，同時也和接枝過程中的多糖有關(guān)。有研究表明葡聚糖能夠顯著提高花生蛋白的乳化性能［3］，但葡聚糖分子量對于葡聚糖的性質(zhì)會產(chǎn)生影響。

目前對于葡聚糖分子量的改變是否影響接枝產(chǎn)物性質(zhì)的研究鮮有報道。鑒于此，本文選用10、20、40以及70 kDa四種不同分子量的葡聚糖與花生分離蛋白接枝形成相應(yīng)接枝共價聚合物，并結(jié)合內(nèi)源熒光光譜、遠(yuǎn)紫外圓二色譜、表面疏水性、表面張力等技術(shù)手段對其結(jié)構(gòu)特性和所形成乳濁液的流變學(xué)特性進(jìn)行分析，多角度觀察不同分子量的葡聚糖接枝花生分離蛋白形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生分離蛋白(PPI) 上海源葉生物科技有限公司(凱氏定氮法測定的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)85.33%);葡聚糖(相對分子量10、70 kDa) 合肥博美生物科技有限公司;葡聚糖(相對分子量20、40 k Da) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;金龍魚食用調(diào)和油 上海嘉里食品工業(yè)有限公司;β－巰基乙醇 合肥博美生物科技有限公司;8－苯胺基－1－苯磺酸 薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司;其它試劑 西隴化工股份有限公司。

T－25IKA均質(zhì)機(jī) 德國IKA公司;AH－BASIC高壓均質(zhì)機(jī) 安拓思納米技術(shù)(蘇州)有限公司;HJ－4磁力攪拌器 金壇區(qū)白塔新寶儀器廠;ZS90納米粒度、Zeta電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司;UV－1800紫外－可見分光光度計 上海美諾達(dá)儀器有限公司;Mos－450圓二色譜儀 法國Biologic公司;DCAT21自動化表面張力儀 德國Dataphysics公司;MCR302高級旋轉(zhuǎn)流變儀 奧地利安東帕(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 接枝反應(yīng)產(chǎn)物制備 分別稱取不同相對分子量的葡聚糖與PPI等質(zhì)量混合，分散在去離子水中(確保蛋白和多糖的混合物剛好溶解即可)，用磁力攪拌器攪拌1 h，使蛋白和多糖充分溶解，然后將混合溶液冷凍干燥，完成后將凍干后的粉末置于溫度60℃、濕度79%的環(huán)境下反應(yīng)3 d，取樣，置于干燥器中，備用［9］。

制得接枝反應(yīng)產(chǎn)物:PPI和葡聚糖10 kDa(Dex 1)共價聚合物(PDC1)、PPI和葡聚糖20 kDa(Dex 2)共價聚合物(PDC2)、PPI和葡聚糖40 k Da(Dex 4)共價聚合物(PDC4)、PPI和葡聚糖70 kDa(Dex 7)共價聚合物(PDC7)。相應(yīng)的PPI和葡聚糖未發(fā)生接枝反應(yīng)的共混物:PDM1、PDM2、PDM4、PDM7，另外，Heat－PPI是經(jīng)過接枝反應(yīng)條件處理后的產(chǎn)物。

1.2.2 乳濁液的制備 將PPI蛋白樣品或者接枝后的蛋白－多糖樣品分散于10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液中，使得樣品終濃度為2%。將混合好的樣品溶液置于4℃的冰箱中24 h，保證溶液中的樣品能充分水化。然后，向水化后的樣品溶液滴加食用大豆油，使得最終混合溶液中油的比例為10%(w/w)，將其用高速剪切機(jī)以24000 r/min剪切1 min形成初步乳濁液，然后再將初步乳濁液用高壓均質(zhì)機(jī)以70 MPa的壓力均質(zhì) 2 min，反復(fù)均質(zhì)3次，最終制備成乳濁液［10］。

1.2.3 接枝度的測定 共價聚合物的接枝度按照OPA法進(jìn)行測定［11］。OPA試劑的配制:將 40 mg OPA用1 mL甲醇溶解，然后加入25 mL濃度為10 mmol/L四硼酸鈉溶液、2.5 mL 20% 濃度的SDS溶液以及100μLβ－巰基乙醇溶液，混合均勻后，用蒸餾水定容至50 mL得到OPA試劑。

用10 mmol/L，pH7.0的磷酸鹽緩沖液將各樣品進(jìn)行溶解，配制成終濃度為2 mg/mL的樣品溶液。取200μL樣品溶液加入4 mL的OPA試劑中，35℃下反應(yīng)2 min，然后用分光光度計在340 nm下比色。以 Lys作標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=7.5171x+0.0128，R2=0.9993)計算出樣品中的自由NH2的含量。利用公式(1)計算接枝度(Degree of grafting，DG):

其中:A0為接枝前的樣品中自由NH2含量(g)，At為接枝后樣品中的自由NH2含量(g)，A為PPI中的自由NH2含量(g)。

1.2.4 遠(yuǎn)紫外圓二色譜掃描 遠(yuǎn)紫外圓二色譜圖(Far－UV－CD)用于分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，可以通過圓二色譜圖了解到蛋白質(zhì)的α－螺旋、β－折疊、β－轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等二級結(jié)構(gòu)變化情況。將各待測樣品用10 mmol/L、pH7.0的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行溶解，終濃度為0.2 mg/mL，磷酸鹽緩沖液作為空白對照。圓二色光譜測定時參數(shù)設(shè)定:掃描波長為190～250 nm，所用樣品池光程為2 mm，分辨率為0.5 nm，掃描速度100 nm/min，靈敏度為100 mdeg/cm，試驗溫度為25℃。得到蛋白質(zhì)的平均摩爾橢圓吸光率用［θ］(deg cm2dmol－1)表示［12］。

1.2.5 內(nèi)源熒光光譜掃描 分別稱取一定量各樣品，用10 mmol/L磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(p H7.0)進(jìn)行充分溶解，終濃度為0.15 mg/mL，用熒光分光光度計對各樣品進(jìn)行發(fā)射波長掃描，記錄各樣品的熒光光譜。熒光分光光度計參數(shù)設(shè)置激發(fā)波長為290 nm，掃描速度為10 nm/s，掃描范圍為300～400 nm，狹縫寬度為 5 nm［13］。

1.2.6 表面疏水性測定 表面疏水性采用ANS熒光探針法進(jìn)行測量。將2 mg/mL的樣品溶液用10 mmol/L，pH7.0的磷酸鹽緩沖液分別稀釋至0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg/mL 濃度，并用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液配制8 mmoL的8－苯胺基－1－苯磺酸(ANS)溶液。每種濃度下的樣品溶液分別取4 mL于不同試管中，加入20μL ANS，用旋渦振蕩器混合均勻，然后用熒光分光光度計記錄下各樣品的熒光強(qiáng)度。熒光分光光度計參數(shù)設(shè)置:激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm，狹縫寬度為5 nm。以熒光強(qiáng)度對樣品濃度作圖，曲線的初始斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)(H0)［14］。

1.2.7 表面電勢測定 采用Malvern公司的Zeta電位儀測定樣品的表面電勢，首先將各待測樣品先用10 mmol/L，pH7.0的磷酸鹽緩沖液配制成2 mg/mL的溶液，在測定表面電勢前，將各待測溶液用相同磷酸鹽緩沖溶液稀釋至0.001%的濃度。然后在25℃環(huán)境下重復(fù)測定3次，取平均值為最終測定結(jié)果［15］。

1.2.8 表面張力測定 采用表面張力儀來測定1.2.2中制備的乳濁液樣品的表面張力。在20℃下對表面張力測定3次，取平均值為最終結(jié)果，表面張力(γ)結(jié)果和臨界膠束濃度(CMC)可以從儀器中直接讀取，然后根據(jù)γ值和CMC值結(jié)果和吉布斯吸附方程計算出表面吸附量(Γ)，方程如下:

式中:C值是濃度(mg/mL)，R是氣體常數(shù)，T是絕對溫度(℃)。表面吸附量中的每個分子的平均面積(A)是根據(jù)以下公式計算所得:

其中:N是阿伏伽德羅常數(shù)［16］。

1.2.9 乳化性及乳化穩(wěn)定性測定 將各待測樣品用10 mmol/L，pH7.0的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行溶解，使得終濃度為2 mg/mL。將蛋白質(zhì)溶液和大豆油按體積比3∶1混合并在均質(zhì)機(jī)下以20000 r/min攪拌1 min獲得乳狀液。攪拌完后，立即用移液槍吸取50μL底部乳狀液，加入5 mL的0.1%SDS溶液中，稀釋后，用分光光度計在500 nm波長下測定吸光度。待乳狀液靜置10 min后，同樣吸取底部乳狀液50μL，加入5 mL的0.1%SDS溶液中進(jìn)行稀釋，然后在500 nm波長下測定吸光度。乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)計算公式見式(4)和式(5):

式中:DF為稀釋倍數(shù)100;C為乳化液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度;φ為比色皿的厚度1 cm;為乳化液中油的體積分?jǐn)?shù)0.25;A0為0 min時取樣測定的吸光度;A10為10 min時取樣測定的吸光度［17］。

1.2.10 流變性質(zhì)測定 采用安東帕MCR302型流變儀，對1.2.2中制備的乳濁液樣品的流變性質(zhì)進(jìn)行測定，測定參數(shù)為:50 mm的錐板，穩(wěn)態(tài)流動爬升范圍為0.01～100 s－1，溫度為25℃，在此條件下進(jìn)行剪切速率掃描，記錄下數(shù)據(jù)。并對數(shù)據(jù)采用Ostwald－de Waele模型進(jìn)行擬合，公式如式(6):

式中:σ(Pa)為剪切應(yīng)力，γ(s－1)為剪切速率，K(Pa·s)為稠度系數(shù)，n 為流變指數(shù)［18］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗最少重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件處理，得到的結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，并使用Origin 8.5軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子量的葡聚糖與PPI的接枝能力分析

圖1為不同分子量的葡聚糖與PPI發(fā)生反應(yīng)生成的共價聚合物的接枝度測定結(jié)果。可以發(fā)現(xiàn)，不同分子量大小的葡聚糖都能與PPI發(fā)生接枝反應(yīng)且難易程度有較大差別，其中Dex 1最易與PPI發(fā)生接枝反應(yīng)，同樣反應(yīng)條件下，其與PPI的接枝產(chǎn)物PDC1接枝度達(dá)到48.1%左右，而其它分子量與PPI的相應(yīng)接枝產(chǎn)物中，PDC2接枝度 37.2%附近，PDC4和PDC7則更低，在20%左右。可以看出，隨著葡聚糖分子量的增加，其越難與PPI發(fā)生接枝反應(yīng)，這可能由于分子量小的葡聚糖反應(yīng)性更高，且接枝到蛋白上的多糖分子形成的空間位阻對結(jié)合比有影響［19］。

圖1 不同分子量葡聚糖與PPI共價聚合物的接枝度Fig.1 The graft degree of covalent polymer generated by different molecular weight of dextran and PPI

2.2 圓二色譜分析

通過遠(yuǎn)紫外圓二色譜可以對PPI發(fā)生接枝反應(yīng)前后的二級結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析。圖2是PPI以及PPI與不同多糖發(fā)生接枝反應(yīng)后的共價聚合物的圓二色譜圖，從圖2中可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)生接枝反應(yīng)后的蛋白的圓二色譜曲線發(fā)生了明顯變化，在192 nm處α－螺旋構(gòu)象特征峰強(qiáng)度減小，210 nm附近也發(fā)生了明顯的減弱現(xiàn)象，表明發(fā)生接枝反應(yīng)后PPI的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變。

圖2 不同共價聚合物和PPI的圓二色譜圖Fig.2 The circular dichroism spectra of different covalent polymers and PPI

通過軟件CDtool計算得到PPI發(fā)生接枝反應(yīng)前后具體二級結(jié)構(gòu)比例變化情況，如表1所示，可以發(fā)現(xiàn)發(fā)生接枝反應(yīng)后的PPI的α－螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)減少，β－折疊和β－轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增加，這種變化表明，發(fā)生接枝反應(yīng)后PPI的內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)折疊程度發(fā)生了改變。其中PDC1和PDC2的α－螺旋結(jié)構(gòu)減少比例相對較高，根據(jù) Hattori等［20］的研究，α－螺旋結(jié)構(gòu)的減少主要是由于ε－氨基與多糖的結(jié)合所引起的，可以說明多糖與蛋白之間發(fā)生了接枝反應(yīng)。而β－折疊和β－轉(zhuǎn)角兩種結(jié)構(gòu)的增多，表明發(fā)生接枝反應(yīng)后的共價聚合物結(jié)構(gòu)變得更加松散。

表1 不同共價聚合物和PPI的二級結(jié)構(gòu)Table 1 Secondary structure distributions of different covalent polymers and PPI

2.3 內(nèi)源熒光光譜分析

含有芳香族氨基酸色氨酸(trptophan，Trp)、酪氨酸(tyrosine，Tyr)和苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)殘基的蛋白質(zhì)在280 nm或295 nm激發(fā)光的激發(fā)下會產(chǎn)生熒光，這種熒光稱為內(nèi)源性熒光(天然熒光)。因此，可以通過蛋白質(zhì)產(chǎn)生的內(nèi)源熒光強(qiáng)度的改變來了解蛋白的構(gòu)象變化［21］。

如圖3和圖4所示，PPI與葡聚糖的共混物由于多糖的遮蔽作用，引起最大熒光強(qiáng)度的降低，最大熒光發(fā)射波長卻沒有明顯偏移，而PPI和葡聚糖發(fā)生接枝反應(yīng)生成共價聚合物后，以主要作用力共價鍵形式結(jié)合在蛋白多肽鏈上的多糖，會對蛋白表面Trp殘基形成遮蔽作用，引起最大熒光強(qiáng)度的降低，同時由于接枝引起蛋白結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致最大熒光發(fā)射波長發(fā)生紅移現(xiàn)象，這種現(xiàn)象越明顯，表明發(fā)生反應(yīng)后的蛋白擁有更加松散的三級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致內(nèi)部疏水性基團(tuán)得以暴露，從而引起表面疏水性的改變［22］。

圖3 不同共混物和Heat－PPI的內(nèi)源熒光光譜Fig.3 The intrinsic emission fluorescence spectra of different blend and Heat－PPI

圖4 不同共價聚合物和PPI的內(nèi)源熒光光譜Fig.4 The intrinsic emission fluorescence spectra of different covalent polymers and PPI

表2是PPI和不同分子量葡聚糖共價聚合物的最大熒光對應(yīng)的發(fā)射波長，可以發(fā)現(xiàn)蛋白與多糖共混物以及Heat－PPI最大熒光對應(yīng)的發(fā)射波長無明顯改變，而蛋白－多糖共價聚合物的最大熒光對應(yīng)的發(fā)射波長都發(fā)生了紅移現(xiàn)象，其中PDC1、PDC2紅移現(xiàn)象更明顯，結(jié)合接枝度結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，這兩種共價聚合物的蛋白－多糖的接枝度也是最高的，可以說明多糖與蛋白發(fā)生接枝反應(yīng)會引起蛋白三級結(jié)構(gòu)的改變，而蛋白與多糖直接混合以及在反應(yīng)溫度下的加熱都不會引起蛋白結(jié)構(gòu)的改變。

表2 不同樣品的最大熒光強(qiáng)度對應(yīng)的波長Table 2 The wavelength corresponding tothe biggest fluorescence intensity of different samples

2.4 表面疏水性分析

蛋白質(zhì)具有特定的空間結(jié)構(gòu)，在其形成過程中，非極性氨基酸由于疏水性會趨向于進(jìn)入蛋白質(zhì)內(nèi)部，而極性氨基酸會分布于蛋白表面［23］。蛋白質(zhì)的表面疏水性強(qiáng)弱與蛋白質(zhì)表面的疏水性基團(tuán)的變化情況有著密切聯(lián)系。因此，可以通過觀察蛋白質(zhì)的表面疏水性變化來分析蛋白的一些性質(zhì)以及結(jié)構(gòu)的變化。

圖5為PPI以及PPI與不同分子量的葡聚糖共價聚合物的表面疏水性結(jié)果。從圖5中可以發(fā)現(xiàn)，PPI發(fā)生接枝反應(yīng)后形成的共價聚合物的表面疏水性均得到了明顯升高，其主要原因是，一方面發(fā)生接枝反應(yīng)時，多糖接枝到蛋白的肽鏈上，會引起蛋白肽鏈的伸展，從而結(jié)構(gòu)變得松散，內(nèi)部的疏水性基團(tuán)得以暴露，最終導(dǎo)致蛋白疏水性增強(qiáng);另一方面接枝到蛋白上的多糖也會攜帶部分疏水性基團(tuán)，在發(fā)生反應(yīng)時，會遷移到蛋白的表面，引起蛋白表面疏水性的增加［24］。可以看到，PDC2的分子表面疏水性指數(shù)變化最大，達(dá)到了783±19，表面疏水性的改變會引起PDC2分子在水溶液中疏水作用力的改變。

圖5 不同共價聚合物和PPI的表面疏水性結(jié)果Fig.5 The surface hydrophobicity of different covalent polymers and PPI

2.5 Zeta電位分析

Zeta電位通常被用來確定膠體溶液體系的穩(wěn)定性狀況。它能用于分析膠體顆粒間作用力的強(qiáng)度，是判斷穩(wěn)定性的一項重要指標(biāo)。通常情況下，體系中膠體顆粒的表面Zeta電位越高，顆粒間的排斥力表現(xiàn)得越大，越不容易發(fā)生聚集沉淀，則體系會表現(xiàn)得相對穩(wěn)定，相反，如果體系中膠體顆粒的表面Zeta電位較低，顆粒間的較弱的靜電排斥力會容易導(dǎo)致顆粒間相互靠近，引起膠體體系出現(xiàn)聚集沉淀等不穩(wěn)定現(xiàn)象［25－26］。

圖6反映了PPI以及PPI與不同分子量葡聚糖共價聚合物水溶液的表面Zeta電位情況。由圖6中可以看到，不同分子量葡聚糖與PPI反應(yīng)形成的共價聚合物水溶液之間Zeta電位有較大差異，且與PPI的表面Zeta電位比較也有較明顯的變化，Zeta電位的絕對值有明顯的提升，其中PDC2提升幅度最大，達(dá)到了－23.4 mV，表明PDC2在水溶液體系中時，由于分子間存在靜電作用力，體系會表現(xiàn)出更加穩(wěn)定的狀態(tài)。

圖6 不同共價聚合物和PPI的Zeta電位Fig.6 The Zeta potential of different covalent polymers and PPI

2.6 表面張力分析

表面張力一般是指液體與氣體或其它不相容的液體以及固體相接觸時，在接觸面表現(xiàn)出的一種作用力，這種作用力可以讓液體表面層表現(xiàn)出收縮趨勢，盡可能減小其表面接觸面積。表3是不同共價聚合物和PPI溶液的表面張力結(jié)果。

從表3中可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)生接枝反應(yīng)后的共價聚合溶液，其表面張力值及CMC值較PPI溶液都有提高，另外，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)樣品的表面吸附量Γ值最大時，同時會表現(xiàn)出最小的分子面積。從各樣品的表面吸附量Γ值結(jié)果可以看出，接枝反應(yīng)后的共價聚合物溶液的Γ值大于PPI，且表現(xiàn)出更小的分子面積，其中PDC2變化最為明顯，表明接枝反應(yīng)后共價聚合物分子在溶液中能夠更好地分散開，在溶液界面上每個分子占有的面積更小，分子間作用更明顯，因此，會表現(xiàn)出更好的分子內(nèi)聚力，引起表面張力的增加。

表3 不同共價聚合物和PPI溶液的表面張力和CMCTable 3 The surface tension and CMC of different covalent polymers and PPI solution

2.7 乳化特性分析

蛋白質(zhì)的乳化性主要是通過乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)兩個指標(biāo)來評定的。乳化活性是指蛋白質(zhì)在油水混合時形成的乳濁液體系中單位質(zhì)量的蛋白質(zhì)(g)能夠穩(wěn)定的油水界面的面積(m2);乳化穩(wěn)定性是指蛋白質(zhì)保持油水混合的乳濁液體系對外界環(huán)境的抗應(yīng)變能力［27］。

對PPI以及不同分子量葡聚糖與PPI共價聚合物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性進(jìn)行分析。結(jié)果如圖7所示，可以發(fā)現(xiàn)不同分子量葡聚糖與PPI形成的共價聚合物，其乳化活性和乳化穩(wěn)定性較PPI都有了明顯的改善，但不同共價聚合物的改善程度有較大差異，其中PDC2改善最為明顯，乳化活性達(dá)到了(92.2±1.13)m2/g，較PPI提高了319.1%，乳化穩(wěn)定性達(dá)到了(80.1±0.78)min，較PPI提高了281.4%。結(jié)合前面的結(jié)構(gòu)變化以及表面疏水性表面電勢和表面張力的結(jié)果，可以說明PDC2乳化活性以及乳化穩(wěn)定性的原因。

圖7 不同共價聚合物和PPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性Fig.7 The emulsion activity and emulsion stability of different covalent polymers and PPI

2.8 乳濁液流變特性分析

用數(shù)據(jù)處理軟件對美拉德反應(yīng)共價聚合物和PPI乳濁液的流變性質(zhì)進(jìn)行分析，利用Oswald－de Waele模型對流變數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到相應(yīng)的流變指數(shù)(n)、稠度系數(shù)(K)和決定系數(shù)R2，如表4所示。

表4 不同共價聚合物和PPI乳濁液的稠度系數(shù)和流變指數(shù)Table 4 The consistency coefficient(K)and flow behavior index(n)of different covalent polymers and PPI emulsion

從表4中可以看出，各樣品的流變數(shù)據(jù)用Oswald－de Waele模型擬合程度比較高(R2＞0.98)。n值表示流變指數(shù)(通常n＞1時，剪切變稠體系;n=1時，牛頓流體;n＜1時，剪切稀化體系)。由表4中可以看出，各樣品的n值都小于1，因此，不同共價聚合物和PPI乳濁液體系都為剪切稀化體系。另外，各共價聚合物乳濁液體系的稠度系數(shù)K值較PPI乳濁液體系明顯增大，這主要是因為，一方面加入的葡聚糖自身具有增稠作用，引起乳濁液體系的稠度增加，另一方面接枝反應(yīng)后生成了更加穩(wěn)定的共價聚合物分子，其在乳濁液體系中分子間相互作用力增強(qiáng)，抗剪切作用力增大，引起稠度系數(shù)的增大［28］。從表4中各共價聚合物乳濁液的K值數(shù)據(jù)可以看出，PDC2乳濁液的K值相對較大，表明其抗剪切能力較好，乳濁液體系更加穩(wěn)定，與前文乳濁液穩(wěn)定性結(jié)果相符。

3 結(jié)論

接枝反應(yīng)后的共價聚合物中，蛋白結(jié)構(gòu)較PPI的三級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)都發(fā)生了明顯的變化，在二級結(jié)構(gòu)中，α－螺旋結(jié)構(gòu)減少，β－結(jié)構(gòu)增多，空間結(jié)構(gòu)變得更加松散，其中接枝度越高的共價聚合物PDC1、PDC2結(jié)構(gòu)變化更加明顯。接枝反應(yīng)后的共價聚合物，其表面疏水性和Zeta電位發(fā)生了明顯的改變，其中表現(xiàn)出更好乳化穩(wěn)定性的共價聚合物PDC2溶液體系，表面疏水性和Zeta電位明顯增大。接枝反應(yīng)后的共價聚合物溶液表面張力明顯增強(qiáng)，其中乳化性較好的共價聚合物PDC2能夠表現(xiàn)出更好的表面吸附性，共價聚合物的乳濁液體系抗剪切能力更明顯，體系更加穩(wěn)定。不同分子量的葡聚糖與花生分離蛋白的接枝反應(yīng)，能夠改善花生分離蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性，且以分子量20 kDa的葡聚糖對花生分離蛋白性質(zhì)改善最為明顯。