枝瑚菌多糖的結(jié)構(gòu)及其免疫調(diào)節(jié)活性

董明明，丁 祥，2，宋 波，蔣 琳，劉 影，侯怡鈴，*

(1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川南充637009;2.西華師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川南充637009)

枝瑚菌(Ramaria flaccida(Fr.)Quél.)是一種常見(jiàn)的真菌科類。子實(shí)體小，分枝多且稠密，柄短，通常從柄基部分枝，菌肉柔軟，擔(dān)子細(xì)長(zhǎng)呈棍棒狀［1］。主要分布于安徽、西藏、貴州、云南、四川等地，多生于闊葉林或針葉林地上，一般成叢生生長(zhǎng)，產(chǎn)量較高，但其子實(shí)體現(xiàn)多為野生采摘，未見(jiàn)有人工栽培的報(bào)道。有研究表明，該菌液體發(fā)酵菌絲體與子實(shí)體的化學(xué)組成極為相似，且菌絲產(chǎn)量可達(dá)到9.45 g/L［2－4］。此外，據(jù)報(bào)道，該科各屬含有很多別具風(fēng)味的食用菌，部分枝瑚菌對(duì)于艾氏癌(EC)和小白鼠肉瘤(S－180)有很強(qiáng)抑制作用，是我國(guó)野生食用真菌資源中極為寶貴的組成部分，所以該類真菌具有較大研究?jī)r(jià)值［5］。

食用菌多糖是食用菌子實(shí)體或菌絲中存在的一類活性多糖，是食藥用真菌中能夠起到保健和醫(yī)療的重要成份［6］。研究表明，食用菌多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫機(jī)能、提高心肌保護(hù)、降血脂等生物活性，并且對(duì)人體毒副作用相對(duì)較小，受到越來(lái)越多人的關(guān)注［7－11］。

目前，對(duì)于枝瑚菌的研究主要在其成分含量測(cè)定以及抗氧化上，對(duì)枝瑚菌多糖的免疫調(diào)節(jié)活性方面還沒(méi)有報(bào)道［12］。本文采用熱水浸提法、Sevage法和乙醇醇沉得到粗多糖，再經(jīng)DEAE－52纖維素層析法純化枝瑚菌多糖。在提取分離到純化的枝瑚菌多糖基礎(chǔ)上，采用傅里葉變換紅外光譜儀(FT－IR)，體外細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)其結(jié)構(gòu)和免疫調(diào)節(jié)活性兩個(gè)方面進(jìn)行了研究。通過(guò)此研究有助于開(kāi)發(fā)利用枝瑚菌多糖資源，并且為進(jìn)一步研究其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制以及藥用價(jià)值方面提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枝瑚菌子實(shí)體(Ramaria flaccida(Fr.)Quél) 四川省阿壩藏族羌族自治州小金縣，在西華師范大學(xué)丁祥教授鑒定后，放于烘箱中(65℃)烘干過(guò)夜，待其子實(shí)體樣本完全干燥后，4℃保存于西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;DEAE－52纖維素柱 生興生物技術(shù)(南京)有限公司;透析袋 Sephadex G－200(Mw≥7 kDa) Biosharp公司;NaOH、NaCl和苯酚 生工科技(四川)有限公司;無(wú)水乙醇、濃硫酸、濃鹽酸 上緯精細(xì)化工(上海)有限公司，以上試劑均為分析純;小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞 金凱生物技術(shù)(成都)有限公司;Roswell Park Memorial Institute－1640培養(yǎng)基、雙抗、胎牛血清 Thermo Fisher Scientific公司(美國(guó));脂多糖(LPS) Sigma公司(美國(guó));細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK－8試劑盒) 博升生物科技(上海)有限公司;中性紅試劑 生工生物工程(上海)股份有限公司;一氧化氮檢測(cè)試劑盒 碧云天生物技術(shù)公司;小鼠TNF α、IL－2、IL－6、IL－10 ELISA 免疫試劑盒 博士德生物工程(武漢)有限公司。

TU－1901/1900系列傅立葉紅外光譜儀 北京晶品賽思科技有限公司;BPN－80CH(UV)CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SE－CJ－1F型－超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;318Mc型－酶標(biāo)儀 上海三科儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 枝瑚菌多糖的分離提取 精確稱取枝瑚菌子實(shí)體500 g，將其剪成小段放于烘箱中，65℃烘干過(guò)夜，第2 d取出子實(shí)體用粉碎機(jī)粉碎，將子實(shí)體粉末和蒸餾水以1∶30(g/mL)的比例在95℃的恒溫水浴鍋中水浴攪拌3 h，后將混合液10000 r/min離心15 min，收集上清液并且用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)濃縮至200 mL［13－14］。然后用 Sevage 法除去濃縮液中的蛋白質(zhì)，然后加入三倍體積的無(wú)水乙醇并攪拌，出現(xiàn)絮狀沉淀物，收集沉淀并放入烘箱(65℃)干燥處理，得到枝瑚菌粗多糖［15］。將粗多糖加蒸餾水溶解，最終溶解的體積為200 mL。取3 mL加入到DEAE－52纖維素柱中，以5 mL/min的流速通過(guò)，然后用150 mL蒸餾水過(guò)柱，收集洗脫液［16］。用硫酸－苯酚法測(cè)定洗脫液多糖［17］。將洗脫液濃縮至5 mL，用透析袋透析，持續(xù)3 d，早晚?yè)Q蒸餾水，除去小分子化合物，凍干［18］。得到純化的枝瑚菌多糖，命名為RF－S。

1.2.2 傅里葉變換紅外光譜儀(FT－IR)測(cè)定RF－S的結(jié)構(gòu) 取2 mg RF－S與200 mg干燥的KBr研磨混勻后壓片，用 FT－IR 在 4000～400 cm－1區(qū)間內(nèi)掃描［19］。

1.2.3 RF－S對(duì)巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的增殖作用 采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK－8法)測(cè)定RF－S對(duì)巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的增殖影響［20－21］。將 PBS 緩沖液(NaCl 8 g+KCl 0.2 g+Na2HPO41.44 g+KH2PO40.24 g+H20 1000 mL)(p H=7)加入96孔板四周，其余每孔分別加入100μL的1×105CFU/mL濃度的細(xì)胞懸浮液，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。空白對(duì)照組的每孔分別加入培養(yǎng)液(RPMI－1640培養(yǎng)基90%+胎牛血清10%+雙抗1%);陽(yáng)性對(duì)照組的每孔分別加入100μL脂多糖(LPS)溶液，終濃度為5μg/mL;RF－S藥物組的每孔分別加入100μL RF－S溶液(質(zhì)量終濃度為 0.625、1.25、2.5、5 μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。然后每孔加入5μL CCK－8溶液孵育3 h，測(cè)定450 nm下吸光值，記錄結(jié)果，并拍照。其增值率(%)=［OD(實(shí)驗(yàn)組)－OD(空白對(duì)照組)］/OD(空白對(duì)照組)×100。注:實(shí)驗(yàn)組即為陽(yáng)性對(duì)照組和四個(gè)RF－S藥物組。

1.2.4 RF－S對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響 用中性紅法檢測(cè)RF－S對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響［22－23］。將 PBS緩沖液加入 96孔板四周，其余每孔分別加入100μL的1×105CFU/mL濃度的細(xì)胞懸浮液，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。空白對(duì)照組:每孔分別加入100μL培養(yǎng)液;陽(yáng)性對(duì)照組:每孔分別加入100μL LPS溶液，終濃度為5μg/mL;RF－S藥物組:每孔分別加入100μL RF－S溶液(質(zhì)量終濃度為0.625、1.25、2.5、5 μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 吸出上清液丟棄，再每孔分別加入100μL 0.075%中性紅溶液，吞噬1～2 h后，吸出中性紅溶液。用PBS洗3次，最后每孔分別加入100μL的細(xì)胞裂解液(乙醇∶乙酸 =1∶1，v∶v)裂解 2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng) 540 nm處的OD值。

1.2.5 RF－S對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球能力的影響 與中性紅的吞噬實(shí)驗(yàn)類似，加藥繼續(xù)培養(yǎng)后，吸出上清液，再每孔加入100μL預(yù)處理過(guò)的熒光微球(微球濃度為1 ×107/mL)，吞噬1～2 h，吸出上清［24］。PBS洗3次，再加入100μL/孔細(xì)胞裂解液(乙醇∶乙酸 =1∶1，v∶v)裂解2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)505 nm 處的OD值。

1.2.6 RF－S對(duì)巨噬細(xì)胞釋放NO能力的影響 將PBS緩沖液加入96孔板四周，其余每孔分別加入100μL的濃度為1×105CFU/mL的巨噬細(xì)胞稀釋液，37℃培養(yǎng)24 h。空白對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組各依次分別加入:100μL細(xì)胞培養(yǎng)液、終濃度為5μg/mL的LPS溶液(陽(yáng)性對(duì)照)以及不同濃度的RF－S(終濃度為1.25、2.5、5 μg/mL)，5%CO2，37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。收集上清液，按照一氧化氮檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)540 nm處的OD值，用亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算培養(yǎng)上清液中 NO 含量(μmol/mL)［25－26］。

1.2.7 RF－S 對(duì)巨噬細(xì)胞的釋放 IL－2、IL－6、IL－10和TNFα能力的影響 將PBS緩沖液加入96孔板四周，其余每孔分別加入100μL的濃度為1×105CFU/mL的巨噬細(xì)胞稀釋液，37℃培養(yǎng)24 h。空白對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組各依次分別加入:100μL細(xì)胞培養(yǎng)液、終濃度為5μg/mL的LPS溶液(陽(yáng)性對(duì)照)以及終濃度為5 μg/mL 的RF－S，5%CO2，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集藥物組(LPS、RF－S)和空白對(duì)照組的上清液，按照ELISA免疫試劑盒中說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng) 450 nm 處的 OD 值［27－28］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析，用t－test檢驗(yàn)差異的顯著性，與對(duì)照組對(duì)比，差異顯著用*表示(p＜0.05)，差異極顯著用＊＊表示(p＜0.01)，差異不顯著(p＞0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 FTIR測(cè)定RF－S結(jié)構(gòu)

徐紅霞等［29］所研究的野生枝瑚菌多糖主要由甘露糖和葡萄糖兩種單糖組成，但對(duì)枝瑚菌多糖中單糖的成環(huán)形式等精細(xì)結(jié)構(gòu)未作報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用傅里葉紅外光技術(shù)(FT－IR)測(cè)定RF－S結(jié)構(gòu)，在如圖1所示RF－S的紅外光譜中，3427.72 cm－1為糖類分子內(nèi)或分子間氫鍵O－H的伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明存在分子間和分子內(nèi)氫鍵;2929.28 cm－1的吸收峰是C－H的伸縮振動(dòng)引起的;在1637.22 cm－1為C=O，C=C振動(dòng)峰;1401.89和1334.61 cm－1處的吸收峰，表明存在C－H的彎曲振動(dòng);1259.84 cm－1處的吸收峰是環(huán)上碳－氧(C－O)吸收峰。在 1200～1000 cm－1范圍內(nèi)，1102.39、1079.46 和1045.50 cm－1為C－O－H 伸縮振動(dòng)和吡喃環(huán)中醚鍵C－O－C伸縮振動(dòng)。在884.99 cm－1的吸收峰是該多糖吡喃環(huán)的β－型異頭C－H變角振動(dòng)引起的。619.36 cm－1被認(rèn)為是由C－H搖擺振動(dòng)峰引起的。由此可初步證明此物質(zhì)為多糖結(jié)構(gòu)，特征峰明顯，無(wú)其他結(jié)構(gòu)特征峰，應(yīng)為多糖純品，且其多糖中的單糖是以吡喃糖苷的形式存在［30］。

圖1 RF－S的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectrum of RF－S

2.2 RF－S對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖作用

多糖抗腫瘤性與多糖的抗氧化性和能提高機(jī)體免疫能力密切相關(guān)［31］。李華等［32］研究已表明，RF－S具有良好的抗氧化性。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用細(xì)胞學(xué)技術(shù)，從體外水平，以巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為靶細(xì)胞研究了RF－S的免疫調(diào)節(jié)活性。T淋巴細(xì)胞增殖效果如圖2所示，在0.625～5μg/mL濃度下，其增殖率與藥物的濃度劑量呈正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)多糖濃度在0.625μg/mL時(shí)，T淋巴細(xì)胞增殖率達(dá)20.32%(與空白對(duì)照組相比，差異極顯著(p＜0.01))，當(dāng)濃度為 1.25、2.5μg/mL時(shí)，增殖率分別為54.91%、57.01%(與空白對(duì)照組相比，差異極顯著(p＜0.01))，超過(guò)了5μg/mL LPS的增殖效果。當(dāng)RF－S濃度為5μg/mL時(shí)，T淋巴細(xì)胞增殖率達(dá)到了62.66%(與空白對(duì)照組相比，差異極顯著(p＜0.01))。T淋巴細(xì)胞的增殖形態(tài)如圖3所示，隨著RF－S濃度逐漸增加，細(xì)胞分裂加快，細(xì)胞數(shù)增多。

圖2 RF－S對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖作用Fig.2 The effect of RF－S on the proliferation of T lymphocytes注:＊＊表示與空白對(duì)照組相比，差異極顯著(p＜0.01);*表示與空白對(duì)照組相比，差異顯著(p＜0.05)，圖4、圖6、圖 8～圖 11 同。

圖3 RF－S對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖形態(tài)的影響Fig.3 The cell morphology effect of RF－Son the proliferation of T cell注:(a)為空白對(duì)照組，(b)為L(zhǎng)PS組(5μg/mL);(c)～(f)為RF－S實(shí)驗(yàn)組，質(zhì)量濃度分別為0.625、1.25、2.5、5 μg/mL。圖5～圖7 同。

2.3 RF－S對(duì)B淋巴細(xì)胞的增殖作用

B淋巴細(xì)胞增殖效果如圖4所示，與空白對(duì)照組相比，RF－S藥物組與LPS組能極顯著地促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖(p＜0.01)，并呈一定的劑量關(guān)系。當(dāng)RF－S濃度在5μg/mL時(shí)，其增殖率達(dá)到最大，為67.05%(與空白對(duì)照組相比，差異極顯著(p＜0.01))。圖5顯示，與空白對(duì)照組相比，RF－S藥物組的B淋巴細(xì)胞成團(tuán)明顯增大，數(shù)量明顯增加，當(dāng)濃度在5μg/mL時(shí)，細(xì)胞成團(tuán)最大，數(shù)量最多。

圖4 RF－S對(duì)B淋巴細(xì)胞的增殖作用Fig.4 The effect of RF－S on the proliferation of B lymphocytes

圖5 RF－S對(duì)B淋巴細(xì)胞增殖形態(tài)的影響Fig.5 The cell morphology effect of RF－Son the proliferation of B cell

2.4 RF－S對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖作用

巨噬細(xì)胞增殖效果如圖6所示，當(dāng)加藥(RF－S和LPS)刺激時(shí)，巨噬細(xì)胞的增值率極顯著高于未加藥的空白對(duì)照組(p＜0.01)，而且巨噬細(xì)胞數(shù)量的增加與RF－S的濃度呈劑量依賴關(guān)系。但RF－S在濃度為0.625～2.5μg/mL時(shí)，增殖效果仍然不及LPS對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖影響強(qiáng)。在5μg/mL的RF－S組中，巨噬細(xì)胞的增殖率明顯高于5μg/mL的LPS組。由圖7可看出，在藥物刺激下，巨噬細(xì)胞數(shù)量增加十分明顯。

圖6 RF－S對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖作用Fig.6 The effect of RF－S on the proliferation of macrophage

圖7 RF－S對(duì)巨噬細(xì)胞增殖形態(tài)的影響Fig.7 The cell morphology effect of RF－Son the proliferation of macrophages

2.5 RF－S對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響

巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的結(jié)果如圖8所示，在RF－S濃度為1.25μg/mL時(shí)，巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力略有提高但未達(dá)顯著水平(p＞0.05);在LPS(5 μg/mL)以及RF－S(2.5、5 μg/mL)刺激下，巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力極顯著提高(p＜0.01)，當(dāng)RF－S在5μg/mL時(shí)，藥物組的 OD值最大，略高于LPS組5μg/mL刺激下的OD值，在所有組中對(duì)中性紅的吞噬能力最強(qiáng)。

圖8 RF－S對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響Fig.8 Effect of RF－Son the ability of macrophages to swallow neutral red

2.6 RF－S對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球能力的影響

巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球能力的結(jié)果如圖9所示，RF－S能夠以1.25～5μg/mL劑量的濃度提高巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球的能力(p＜0.01)。巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球的能力與RF－S的濃度呈正相關(guān)。當(dāng)RF－S在5μg/mL時(shí)，藥物組的OD值最大，表明此時(shí)巨噬細(xì)胞的吞噬能力最強(qiáng)。

圖9 RF－S對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球能力的影響Fig.9 Effect of RF－Son the ability of macrophages to phagocytize fluorescent microspheres

2.7 RF－S對(duì)巨噬細(xì)胞釋放NO能力的影響

巨噬細(xì)胞釋放NO能力的結(jié)果如圖10所示，當(dāng)濃度在1.25～2.5μg/mL范圍之間時(shí)，RF－S能刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，但未達(dá)顯著水平(p＞0.05)。而在濃度為5μg/mL時(shí)，RF－S可以非常顯著地刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO(p＜0.01)，在三個(gè)RF－S藥物試驗(yàn)組中，NO釋放量最高;但與LPS 5μg/mL試驗(yàn)組比較，NO釋放量仍很低。

圖10 RF－S對(duì)巨噬細(xì)胞釋放NO能力的影響Fig.10 The effect of RF－Son the ability of macrophages to release NO

2.8 RF－S 對(duì)巨噬細(xì)胞釋放 IL－2、IL－6、IL－10 和TNFα能力的影響

巨噬細(xì)胞釋放 IL－2、IL－6、IL－10和 TNF α 能力見(jiàn)圖11，RF－S藥物組與LPS組均能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL－2、IL－6、IL－10 和 TNF α。且5 μg/mL 的 RF－S刺激巨噬細(xì)胞分泌IL－2、IL－10和TNFα與空白對(duì)照組相比，具有極顯著的增強(qiáng)效果(p＜0.01)，對(duì)刺激巨噬細(xì)胞分泌IL－6有顯著增強(qiáng)效果(p＜0.05)。

圖11 RF－S對(duì)巨噬細(xì)胞釋放 IL－2、IL－6、IL－10和 TNF α 能力的影響Fig.11 The effect of RF－Son the ability of macrophages to release IL－2，IL－6，IL－10 and TNF α

3 結(jié)論

本論文采用傅里葉紅外光技術(shù)(FT－IR)測(cè)定RF－S結(jié)構(gòu)，紅外光譜顯示其有明顯的多糖結(jié)構(gòu)吸收峰，判斷該化合物為糖類化合物，且在884.99 cm－1處存在吸收峰，說(shuō)明其多糖中的單糖是以吡喃糖苷的形式存在。

在此基礎(chǔ)上本文進(jìn)一步對(duì)RF－S的免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，RF－S能極顯著地促進(jìn)巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖(p＜0.01)，并呈一定的劑量關(guān)系。在RF－S濃度為5μg/mL時(shí)，巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖率分別為123%、62.66%和 67.05%;并且 T淋巴細(xì)胞隨著RF－S濃度增加，細(xì)胞分裂加快，細(xì)胞數(shù)增多;B淋巴細(xì)胞成團(tuán)明顯增大，數(shù)量明顯增加。其次，RF－S能夠極顯著提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力(p＜0.01)，當(dāng)RF－S濃度在5μg/mL時(shí)，巨噬細(xì)胞的吞噬能力最強(qiáng)。此外，RF－S能極顯著刺激巨噬細(xì)胞分泌IL－2、IL－10、TNFα和釋放NO(p＜0.01)，顯著刺激巨噬細(xì)胞分泌 IL－6(p＜0.05)。

綜上所述，在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，RF－S發(fā)揮抗腫瘤作用與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞免疫功能有關(guān)。本論文對(duì)枝瑚菌多糖結(jié)構(gòu)和免疫調(diào)節(jié)活性研究的理論研究具有指導(dǎo)意義，對(duì)枝瑚菌資源的高值化利用和相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)具有很大價(jià)值，但其涉及的有關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與其分子機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。