不同預(yù)處理對豆腐柴葉果膠理化性質(zhì)的影響

張 攀，陳 信，熊雙麗，2，* ，薛朝云

(1.西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽621010;2.四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心，四川綿陽621010;3.江油市春雨生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，四川江油621700)

豆腐柴(Premna microphylla Turcz)是馬鞭科豆腐柴屬多年生落葉灌木，其葉子除具有基本營養(yǎng)成分外，還含有大量果膠，大約為 10% ～30%［1－3］。果膠是一種由半乳糖醛酸聚合而成的高分子物質(zhì)，由于其良好的凝膠性、乳化穩(wěn)定性，在食品、醫(yī)藥等多個行業(yè)被廣泛應(yīng)用。目前，市場上售賣的果膠主要以橘皮、蘋果渣為原材料，其果膠含量為20%左右［4－5］。相比之下，豆腐柴葉果膠含量更高，且豆腐柴為野生植物資源，生長條件要求不高，生長迅速，原料豐厚，具有極大的開發(fā)利用價值，可作為一種新型的提取商業(yè)果膠的原材料。

目前，國內(nèi)外關(guān)于豆腐柴葉的報道主要集中在營養(yǎng)成分、“樹葉涼粉”制作和果膠提取工藝及理化性質(zhì)研究等方面［6－8］，原料大多來自安徽、湖北等地，關(guān)于四川地區(qū)豆腐柴葉的研究報道很少［9－10］，且關(guān)于原料預(yù)處理對果膠特性影響的研究較淺。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)豆腐柴葉果膠含量和性質(zhì)存在差異［11］，“樹葉涼粉”的品質(zhì)與豆腐柴葉預(yù)處理和其含有的果膠密切相關(guān)。實驗中常采用蒸汽、微波、酸浸泡、燙漂等方式對原料進行殺青滅酶，民間常采用燙漂方式來軟化組織制作“樹葉涼粉”，采用冷凍方式對原料進行貯藏。為提高原料利用率和果膠得率，探究不同預(yù)處理對豆腐柴葉果膠性質(zhì)的影響，本文以四川江油地區(qū)豆腐柴葉為原料，對新鮮豆腐柴葉進行蒸汽、微波、酸浸泡、燙漂、冷凍等五種預(yù)處理，并對其果膠得率、主要成分、表面形態(tài)、結(jié)構(gòu)特性進行研究，以找出一種相對較優(yōu)的預(yù)處理方式，為更加全面了解四川江油豆腐柴葉果膠及相關(guān)產(chǎn)品的精深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆腐柴葉 采摘于四川綿陽江油豆腐柴基地(江油市春雨生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司);半乳糖醛酸標準品(≥97%) 美國Fluka公司;咔唑、橘皮果膠標品 美國Sigma公司;鹽酸、濃硫酸、無水乙醇、氫氧化鈉、高錳酸鉀等 分析純。

MM823ESJ－PA美的微波爐 佛山市美的微波電器制造有限公司;SF－TDL－550臺式低速大容量離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司;UV－5800PC紫外可見光分光光度計 上海元析儀器有限公司;Frontier紅外吸收光譜儀 美國Perkinelmer公司;3nh色差儀 深圳市三恩馳科技有限公司;UItra55場發(fā)射掃描顯微鏡 德國蔡司儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理 以半乳糖醛酸含量為指標，首先對各預(yù)處理進行單因素實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各預(yù)處理最佳條件分別如下:蒸汽(1 min)、微波(400 W，2 min)、酸浸泡(用 HCl溶液調(diào) pH至 3.0，浸泡30 min)、燙漂(85～90 ℃，2 min)、冷凍(－10 ℃，48 h)。在各預(yù)處理最佳條件下，對新鮮豆腐柴葉分別進行這五種預(yù)處理，以不處理作對照，酸浸泡和燙漂預(yù)處理后，將水瀝干，置于50℃烘箱中烘干，其余預(yù)處理直接烘干，粉碎，過60目篩，室溫密封儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 豆腐柴葉果膠制備 果膠制備工藝［12－13］:新鮮豆腐柴葉經(jīng)預(yù)處理后采用酸提取法［11］(料液比1∶30 g/mL，提取溫度 85 ℃，提取時間 2 h，溶液p H1.6)進行提取，離心取上清液，加入等體積無水乙醇，0.1 mol/L HCl調(diào) p H 至3.5，靜置4 h，離心，棄去上清液，得沉淀。然后進行純化:沉淀加入1/4體積無水乙醇，攪拌、靜置1 h，離心得沉淀;重復(fù)一次;沉淀加入1/4體積70%乙醇，攪拌、靜置1 h，離心得果膠濾餅。最后50℃熱風干燥6 h、粉碎、過60目篩得果膠粉末備用。工藝過程中所有離心條件均為4000 r/min，15 min。橘皮果膠標品、未經(jīng)處理、蒸汽、微波、酸浸泡、燙漂、冷凍預(yù)處理所得到的豆腐柴葉果膠粉末分別用 P0、P1、P2、P3、P4、P5、P6表示。

1.2.3 果膠相關(guān)指標測定

1.2.3.1 果膠得率 得率(%)=果膠產(chǎn)品質(zhì)量×100/豆腐柴葉干粉質(zhì)量。

1.2.3.2 果膠水分、灰分、酸不溶灰分測定 參照GB 25533－2010《食品安全國家標準 食品添加劑 果膠》進行測定。

1.2.3.3 果膠p H測定 用去離子水配制0.1%的果膠溶液，在25℃下用p H計進行測定。

1.2.3.4 果膠半乳糖醛酸含量測定 用去離子水配制0.1 mg/mL的果膠溶液，取1 mL樣液參照陶阿麗等［14］的咔唑硫酸比色法進行測定。

1.2.3.5 果膠酯化度測定 參考彭小燕［15］和蔣立科等［9］的方法，并略作修改。準確稱取果膠粉末0.1 g，用1 mL乙醇濕潤，用去離子水溶解定容到100 mL。充分溶解后加2滴1%酚酞作指示劑，用0.1 mol/L NaOH滴定至顏色變成粉紅色(pH=7.5)，30 s不變色，記錄所用NaOH體積為V1;然后向溶液中加入20 mL 0.5 mol/L NaOH，在室溫下攪拌靜置15 min后加入20 mL 0.5 mol/L鹽酸溶液，再用0.1 mol/L NaOH滴定至粉紅色，30 s不變色，記錄所用NaOH體積為V2。酯化度(DE)計算公式為:DE(%)=V2×100/(V1+V2)。

1.2.3.6 鈣含量測定 參照GB/T 6436－2002《飼料中鈣的測定》中高錳酸鉀法進行測定。

1.2.3.7 色差測定 用色差儀直接測定果膠粉末色澤，以標準白板為參照。

1.2.4 掃描電鏡分析 取適量干燥的果膠粉末，用雙面導(dǎo)電膠粘附在SEM樣品臺上，噴金后觀察果膠微觀形態(tài)并使用電鏡掃描拍照。加速電壓為20 kV，放大倍數(shù)分別為500倍和10000倍［15］。

1.2.5 紅外光譜分析 取2 mg果膠粉末，與100 mg溴化鉀研磨混合后壓片制樣，采用紅外吸收光譜儀在 400～4000 cm－1范圍內(nèi)進行紅外光譜掃描［15］。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 所有實驗均重復(fù)3次，結(jié)果用珚X±SD表示。運用Microsoft Excel 2013和SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，顯著性分析采用單因素方差分析(ONE WAY ANOVA)進行S－N－K法分析，p＜0.05為差異顯著，p＜0.01為差異極顯著。Origin 8.5軟件繪制圖形;Photoshop CS6軟件處理圖像。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同預(yù)處理豆腐柴葉果膠主要成分分析

P0～P6主要成分測定結(jié)果如表1所示。豆腐柴葉果膠得率為8.95%～19.32%，從大到小依次為P2＞P3＞P4＞P1＞P5＞P6，P2得率極顯著(p＜0.01)高于其它預(yù)處理，說明蒸汽、微波預(yù)處理能明顯提高果膠得率，這是因為蒸汽和微波的熱處理可以使與細胞壁結(jié)合的原果膠分離，有助于果膠的溶出;P4較P1得率僅提高0.39%，說明酸浸泡不能很好提高果膠得率，這與Olga A P等［16］的研究結(jié)果不同，可能是因為本文預(yù)處理時所用pH相對較高(本文pH=3，Olga A P等人pH=1)，對原果膠與細胞壁之間的分離沒有起到很好的促進作用;P5、P6得率極顯著(p＜0.01)降低，這是因為燙漂過程造成果膠流失，冷凍后的原料在低酸性環(huán)境下會發(fā)生強降解，從而影響果膠得率［16］。相較于常用商業(yè)果膠原材料橘皮、蘋果渣果膠含量20%左右而言，豆腐柴葉果膠得率明顯更高，這說明豆腐柴葉作為果膠提取的原材料還是具有良好的潛在開發(fā)價值。

除P1～P6酸不溶灰分指標外，其它指標均達到了國家標準。豆腐柴葉果膠半乳糖醛酸含量為69.08%～89.76%，從高到低依次為P2＞P3＞P1＞P4＞P5＞P6，P2極顯著(p＜0.01)高于其它預(yù)處理，說明P2純度最高;P6半乳糖醛酸含量極顯著(p＜0.01)降低，這說明P6純度較低，可能含有較多雜質(zhì)。蒸汽、微波預(yù)處理能大幅度提高果膠得率，且所得到的果膠半乳糖醛酸含量高，所以蒸汽、微波預(yù)處理是相對較優(yōu)的預(yù)處理方式。P1～P6酯化度均大于50%，屬于高酯果膠，比蔣立科等［9］的研究結(jié)果略高，這可能是因為不同地區(qū)豆腐柴果膠酯化度略有不同。P1～P6灰分和酸不溶灰分含量極顯著(p＜0.01)高于P0，可能是因為豆腐柴葉果膠本身含有較多的鈣等礦物元素，通過對鈣含量的測定也驗證了其鈣含量確實比P0高很多，不同預(yù)處理間鈣含量的差異可能與預(yù)處理過程中鈣離子與果膠分子的締合有關(guān)，具體的機理還有待進一步研究。若要獲得更純的豆腐柴葉果膠，還需進一步進行分離純化。

2.2 不同預(yù)處理豆腐柴葉果膠色差分析

各組果膠粉末中，P0、P2為白色粉末，P3、P5為淡黃色粉末，P1、P4、P6為淺棕色粉末，色澤和外觀符合GB 25533－2010標準，不同預(yù)處理對果膠色澤有明顯影響。在果膠提取分離過程中發(fā)現(xiàn)，果膠溶液經(jīng)乙醇沉淀得到的果膠濾餅 P2、P3、P5呈白色，P1、P4、P6呈綠色，這是因為蒸汽、微波、燙漂預(yù)處理都屬于熱處理，能夠有效使酶失活，防止酶褐變，而且在乙醇沉淀過程中色素更容易除去;酸浸泡和冷凍預(yù)處理只能在一定程度上抑制酶活性，不能有效防止氧化。最終果膠粉末的色澤還與干燥方式有關(guān)，本文采用的是熱風干燥，這使得果膠濾餅在干燥過程中發(fā)生了一定程度的褐變。從得到的果膠粉末顏色來看，蒸汽是較佳的預(yù)處理方式。

為更加準確辨別不同預(yù)處理對果膠粉末色澤的影響，對P0～P6的色差進行了測定，其結(jié)果如表2所示。L*表示亮度，其值大小依次為P0＞P2＞P3＞P6＞P5＞P4＞P1，P0亮度極顯著(p＜0.01)大于 P1～P6，不同預(yù)處理間，P2亮度極顯著(p＜0.01)大于其它預(yù)處理亮度，表明蒸汽處理組亮度最好。a*為正值時表示紅度，為負值時表示綠度，其值均為正值，說明果膠粉末有一點偏紅色，其值從大到小為P5＞P6＞P1＞P4＞P2＞P3＞P0，P0紅度極顯著(p＜0.01)低于 P1～P6紅度。b*為正值時表示黃度，為負值時表示藍度，其值均為正值，說明果膠粉末顏色偏黃色，其值大小依次為P4＞P1＞P6＞P5＞P3＞P0＞P2，P2黃度極顯著(p＜0.01)低于其它預(yù)處理黃度，表明P2黃色最淺，這與直接觀測到的果膠粉末黃色深淺一致。c*表示色差飽和度，排序與b*值相同。經(jīng)色差儀驗證，P2色澤最佳，表明蒸汽處理下，果膠色澤最好。

表2 不同預(yù)處理豆腐柴葉果膠粉末色差分析Table 2 Color analysis of different pretreatments pectin powder from Premna microphylla Turcz leaves

2.3 不同預(yù)處理豆腐柴葉果膠掃描電鏡分析

圖1所示是P0～P6在掃描電鏡下分別放大500倍和10000倍所觀察到的形態(tài)結(jié)構(gòu)?？梢钥闯觯琍0和P1～P6呈現(xiàn)出完全不同的形態(tài)，P0在500倍時呈不規(guī)則條狀、塊狀，在10000倍時呈網(wǎng)絡(luò)片狀、表面較光滑;P1～P6在500倍時呈塊狀、厚片狀，在10000倍時表面形態(tài)差異明顯。放大10000倍時，P1表面極其凹凸不平、無明顯分層現(xiàn)象;P2表面光滑、有凸起;P3表面凹凸不平、出現(xiàn)分層、邊緣出現(xiàn)不規(guī)則卷曲;P4表面出現(xiàn)大量分層且部分出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象;P5表面不平整、出現(xiàn)不規(guī)則分層且有裂紋出現(xiàn);P6表面出現(xiàn)少量分層、有坑洼狀、且有球狀物出現(xiàn)。綜上所述，不同預(yù)處理方式對果膠表面形態(tài)有明顯影響，但具體的影響機理還有待進一步探究。除P2表面較光滑外，其它預(yù)處理果膠表面均較粗糙，這再一次說明蒸汽是較優(yōu)的預(yù)處理方式。豆腐柴葉果膠呈塊狀或厚片狀，這與彭小燕［15］、張妍楠［17］等人提取的甜菜、胡柚果膠呈現(xiàn)的薄片狀形態(tài)不同，究其原因可能是果膠原材料來源、果膠干燥方式或提取果膠工藝的不同所致。

圖1 不同預(yù)處理豆腐柴葉果膠電鏡掃描圖Fig.1 SEM images of different pretreatments pectin from Premna microphylla Turcz leaves

圖2 不同預(yù)處理豆腐柴葉果膠紅外光譜圖Fig.2 IR spectroscopy of different pretreatments pectin from Premna microphylla Turcz leaves

2.4 不同預(yù)處理豆腐柴葉果膠紅外光譜分析

圖2中 A、B圖所示是P0～P6的紅外光譜圖。3433 cm－1附近出現(xiàn)的吸收峰是O－H鍵的伸縮振動，峰形寬且鈍，說明羥基非游離態(tài)存在，而是在分子間發(fā)生了締合。在3000～2800 cm－1波長范圍出現(xiàn)的較弱吸收峰是由果膠多糖甲基、亞甲基以及次甲基中C－H鍵的對稱和反對稱伸縮振動引起的［18－21］。1750 cm－1處的吸收峰為羧羰基和酯羰基中C=O鍵的伸縮振動，1636 cm－1處的吸收峰為游離羧基中C=O鍵的非對稱伸縮振動，這兩個特征峰證明提取物為果膠類 多 糖，也 可 用 于 果 膠 酯 化 度 的 確 定［22－24］。1444 cm－1處吸收峰是由－COOH的C－O伸縮振動引起的，證明有果膠特征基團羧基的存在;1237和832 cm－1附近的吸收峰是S=O鍵的伸縮振動，說明果膠含有硫酸根［25］。1400～1200 cm－1的吸收峰是由C－H鍵的變角振動引起的;1200～1000 cm－1的吸收峰是果膠分子中的兩種C－O鍵的變角振動吸收，包括 C－O－H 和 C－O－C 鍵;1049 cm－1處有吸收峰，這是吡喃環(huán)的C－O鍵伸縮振動，說明果膠為吡喃環(huán)結(jié)構(gòu);920 cm－1處為D－葡萄吡喃糖的C－O－C非對稱伸縮振動吸收峰;832 cm－1附近的吸收峰說明可能存在α－D－葡萄吡喃糖、α－D－半乳吡喃糖、β－D－阿拉伯吡喃糖或 α－D－甘露吡喃糖;761 cm－1附近為 α－D－木吡喃糖吸收峰。

從圖2中 A、B圖可以看出，P0～P6在 400～4000 cm－1范圍類均表現(xiàn)出糖類的特征吸收峰，都含有糖醛酸羧基、羥基和硫酸基等果膠多糖主要特征吸收峰，進一步證實了所提取物質(zhì)為果膠。P0～P6反映出的官能團信息一致，表明P0～P6具有相似的化學結(jié)構(gòu)。但P1～P6出現(xiàn)峰值的位置和峰面積略有差異，如3000～2800 cm－1波長范圍出現(xiàn)的C－H鍵伸縮振動，P2出現(xiàn)在 2974.25 cm－1、其余出現(xiàn)在 2929 cm－1左右，S=O鍵的伸縮振動P2出現(xiàn)在880.99 cm－1處、其余出現(xiàn)在832 cm－1左右，吸收峰的位移與質(zhì)量效應(yīng)、電子效應(yīng)、空間效應(yīng)等密切相關(guān)，這表明不同預(yù)處理對果膠分子的組成及空間結(jié)構(gòu)有略微的影響。

3 結(jié)論

豆腐柴葉經(jīng)不同預(yù)處理后，果膠得率為8.95%～19.32%，半乳糖醛酸含量為69.08%～89.76%，表明豆腐柴葉可作為一種新型的提取商業(yè)果膠的原材料。通過蒸汽預(yù)處理，果膠得率可達19.32%，且得到的果膠純度高，說明蒸汽用于果膠提取工藝是最佳的預(yù)處理方式。燙漂、冷凍預(yù)處理后，果膠得率、半乳糖醛酸含量明顯下降，表面形態(tài)粗糙，因此“樹葉涼粉”的制作不建議采用燙漂預(yù)處理，冷凍儲藏也不適合保存用來提取果膠的豆腐柴葉。后續(xù)研究將對豆腐柴葉果膠的一級結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)、加工特性及食用安全性作進一步分析，以期為豆腐柴葉果膠商業(yè)化及相關(guān)新產(chǎn)品開發(fā)提供更多理論和應(yīng)用依據(jù)。