虎杖多糖乙醇分級純化及其抗氧化性

王 佳，李進霞，張慧芝，徐鵬洋，陳忠琴，閆燕艷，*

(1.山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西大同037009;2.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津市現(xiàn)代藥物傳遞及功能高效化重點實驗室，天津300072)

虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)為蓼科蓼屬多年生草本植物，其干燥根莖和根為藥用部位，具有清熱解毒、止咳化痰、利濕退黃、散瘀止痛的功效［1］，臨床用于濕熱黃疸、風(fēng)濕痹痛、水火燙傷、跌撲損傷、癰腫瘡毒等［2］。植物化學(xué)成分分析表明，虎杖中主要含有二苯乙烯類和蒽醌類化合物，此外還含有鞣質(zhì)和多糖等［2］。

多糖的純化常采用纖維素柱層析、透析和凝膠柱層析等方法，限于成本和得率，難以用于大規(guī)模生產(chǎn)［3］。多糖在溶劑中的溶解程度取決于其碳原子數(shù)、分子量及聚合度等多種因素［4］，乙醇分級沉淀法可通過逐步提高乙醇的體積濃度分離純化多糖。相比其它純化方法，乙醇分級沉淀法的優(yōu)勢在于，分級純化多糖的同時仍能維持較高得率，具有廣闊的應(yīng)用價值，如茶多糖［3］、黃芪多糖［5］、白芨多糖［6］等。然而有關(guān)乙醇分級純化虎杖多糖的報道較少，乙醇分級純化過程中虎杖多糖結(jié)構(gòu)及藥理活性變化未見報道。鑒于此，本研究采用乙醇分級沉淀法分離出不同的虎杖多糖，并對其理化性質(zhì)及抗氧化活性進行研究，探討乙醇分級純化對虎杖多糖含量、光譜學(xué)性質(zhì)及抗氧化活性的影響，為虎杖在藥品及保健食品領(lǐng)域中的開發(fā)利用提供實驗及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

虎杖 山西渾源萬生黃芪開發(fā)有限公司;1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH) 美國 Sigma公司;D－葡萄糖、D－半乳糖醛酸 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇、濃硫酸、三氯化鐵 天津市江天化工技術(shù)有限公司，其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

Tensor 27紅外光譜儀 德國Bruker公司;UV－2450紫外分光光度計 日本Shimadzu;BSA623S分析天平 北京賽多利斯儀器有限公司;FW100高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;R213B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生儀器有限公司;DK－98－ⅡA電熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司;FD－1冷凍干燥機 上海豫康儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 虎杖多糖提取及乙醇分級純化 參照文獻［5］，將虎杖藥材粉碎后稱取200 g，按 1∶20(m/v)加入去離子水，于100℃水浴加熱回流提取3次，每次2 h，提取液合并后，在50℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至40 mL，依次加入乙醇，使分級體系中乙醇濃度分別達到30%、50%、70%、90%，每調(diào)節(jié)一次濃度后，將醇沉液放置于4 ℃冰箱中靜置8 h，3000 r·min－1離心15 min，取沉淀用5 mL去離子水充分溶解并冷凍，利用冷凍干燥機在－50℃真空條件下48 h干燥樣品，得到對應(yīng)濃度乙醇沉淀制得的4組多糖，分別標記為 PCP－30、PCP－50、PCP－70、PCP－90，稱重并計算其得率。得率(%)=(粗多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量)×100。

1.2.2 總糖含量測定 采用硫酸苯酚法測定總糖含量［7］，取樣品300 μL，加入5%苯酚300 μL，混勻后加入濃硫酸1.5 mL，靜置后測其在490 nm處的吸光值。以D－葡萄糖為標準品并繪制標準曲線(y=5.9451x+0.0361 R2=0.9943)，比較4組虎杖多糖的總糖含量。所有測定均三次重復(fù)。

1.2.3 糖醛酸含量測定 采用硫酸咔唑法測定糖醛酸含量［7］，取樣品 250 μL，加入四硼法酸鈉溶液1.5 mL，混勻后于100℃水浴中加熱10 min，迅速冷卻，加入50μL咔唑溶液，混勻后于100℃水浴中加熱15 min，迅速冷卻，靜置后測其在525 nm處的吸光值。以D－半乳糖醛酸為標準品，并繪制標準曲線(y=0.0088x+0.029，R2=0.9975)，比較 4 組虎杖多糖的糖醛酸含量。所有測定均三次重復(fù)。

1.2.4 紅外光譜分析 取待測虎杖多糖粉末，以干燥的KBr壓片，采用紅外光譜儀，測其在 4000～400 cm－1波長范圍內(nèi)的吸收光譜［8］。

1.2.5 紫外光譜 取待測虎杖多糖粉末，均配制為0.1 mg/mL的溶液，采用紫外－可見分光光度計，測其在200～400 nm波段范圍內(nèi)的吸收光譜［9］。

1.2.6 DPPH自由基清除活性測定 參照文獻［7］，分別配制不同濃度的虎杖多糖(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL)并取 0.1 mL，加入 DPPH(120μmol/L)2.9 mL混勻，于37℃烘箱中避光30 min，在517 nm處測量吸光值。DPPH自由基清除率的計算公式為:I(%)= ［(Ablank－Asample)/Ablank］×100。以只加入溶劑的反應(yīng)體系設(shè)定為空白對照，Ablank為空白對照的吸光值，Asample為樣品的吸光值。

1.2.7 還原力測定 參照文獻［7］，分別配制不同濃度的虎杖多糖(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL)并取0.1 mL，依次加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(p H=6.6)0.7 mL，1%鐵氰化鉀溶液2 mL充分混勻，于50℃水浴中反應(yīng)20 min，加入10%三氯乙酸2 mL充分混勻，3000 r·min－1離心 10 min，取上清液 1 mL 加入1%三氯化鐵3 mL，混勻后測其在700 nm處的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel及SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 虎杖多糖得率及含量測定結(jié)果

乙醇可降低多糖水溶液的介電常數(shù)，同時減少多糖與水的作用，使多糖聚合沉淀，不同濃度的乙醇可沉淀出對應(yīng)的多糖［10］。乙醇分級純化制備的虎杖多糖的得率，總糖含量、糖醛酸含量見表1，4組多糖得率均表現(xiàn)出顯著性差異(p＜0.05)，其中PCP－30得率最高，可達到1.065 mg/g，其次為PCP－70＞PCP－50＞PCP－90?？偺羌疤侨┧岷拷Y(jié)果顯示，PCP－70和PCP－90差異不顯著(p＞0.05)，其余多糖間均表現(xiàn)出顯著性差異(p＜0.05)，4組虎杖多糖總糖含量由大到小依次為:PCP－70＞PCP－90＞PCP－50＞PCP－30，糖醛酸含量排序為:PCP－70＞PCP－90＞PCP－50＞PCP－30，與總糖含量排列趨勢相同。PCP－70總糖含量及糖醛酸含量最高，且得率較高，與洪彤彤等［6］發(fā)表的研究結(jié)果相一致，其乙醇分級沉淀所得4組白芨多糖中，70%乙醇沉淀所得組分總糖含量最高。結(jié)果表明，相比其他組分，70%沉淀所得多糖組分純度較高，雜質(zhì)少，有利于多糖后期進一步的純化及深入研究。

表1 虎杖多糖得率以及總糖、糖醛酸含量Table 1 The yields，total sugar contents and uronic acid contents of polysaccharides from Polygonum cuspidatum

2.2 虎杖多糖紅外光譜分析

虎杖多糖 PCP－30、PCP－50、PCP－70 及 PCP－90的紅外光譜如圖1所示，3398 cm－1處有寬而強的吸收峰為多糖中O－H的伸縮振動，2924 cm－1處出現(xiàn)的小肩峰為 C－H 的伸縮振動，1448～1236 cm－1間的一組吸收峰為糖類化合物的C－H變角振動［9］，可初步判定4組樣品均為多糖，且1643 cm－1處的吸收峰為C=O的伸縮振動，可推測其為糖醛酸結(jié)構(gòu)［10］，與表1中酸性糖測定結(jié)果一致。1018～1091 cm－1間的一組吸收峰為吡喃糖環(huán)的特征峰［5］，854 cm－1處的吸收峰為 β－端基差向異構(gòu)體的 C－H 變角振動［11］，762 cm－1處吸收峰為α－端基差向異構(gòu)體的C－H變角振動［12］，575 cm－1附近的弱吸收峰可能為－NH2扭曲振動導(dǎo)致的［9］。圖1結(jié)果表明，不同濃度乙醇沉淀所得4組虎杖多糖都具有多糖的典型基團，且所含基團無明顯差異，可推測其化合物組成及分子結(jié)構(gòu)基本相同。這與杜香多糖［13］、桑黃胞內(nèi)多糖［14］分級醇沉的結(jié)果相似，分級醇沉對多糖紅外光譜影響較小。

圖1 虎杖多糖的紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of polysaccharides from Polygonum cuspidatum

2.3 虎杖多糖紫外光譜分析

圖2 為虎杖多糖 4個組分(PCP－30、PCP－50、PCP－70、PCP－90)的紫外掃描圖譜，由圖 2可知，4組多糖在260 nm處均無明顯吸收，推測所得多糖中不含核酸成分，在280 nm處，4組多糖的吸收峰有明顯差異，其中PCP－90吸收最明顯，其次為PCP－70有較小吸收，表明PCP－90及PCP－70中均含有蛋白質(zhì)，其中 PCP－90蛋白質(zhì)含量最高，而 PCP－30及PCP－50吸收峰不明顯，表明蛋白質(zhì)含量較低?？梢娨掖挤旨壋恋聿⒉荒芡耆ザ嗵侵械牡鞍踪|(zhì)，與李璐［15］、趙書凡［16］等得出的結(jié)果相似。

圖2 虎杖多糖的紫外掃描圖譜Fig.2 UV scanning spectra of polysaccharides from Polygonum cuspidatum

2.4 虎杖多糖DPPH自由基清除活性的測定結(jié)果

圖3 為虎杖多糖 4個組分(PCP－30、PCP－50、PCP－70、PCP－90)的DPPH自由基清除率。結(jié)果顯示，在濃度0.5～8 mg/mL范圍內(nèi)，4組虎杖多糖DPPH自由基清除活性均呈現(xiàn)濃度依賴性，濃度越大，清除率越強。比較4組虎杖多糖，PCP－70清除DPPH自由基活性最強［IC50=(4.46±0.32)mg/mL］，其次為PCP－90［IC50=(5.09 ±0.08)mg/mL］，DPPH 自由基清除率由大到小依次為:PCP－70＞PCP－90＞PCP－50 ＞PCP－30。

圖3 虎杖多糖DPPH自由基清除活性Fig.3 Scavenging activity against DPPH radical of polysaccharides from Polygonum cuspidatum

2.5 虎杖多糖還原力的測定結(jié)果

圖4 為虎杖多糖 4個組分(PCP－30、PCP－50、PCP－70、PCP－90)的還原力試驗測定吸光度值。結(jié)果顯示，在濃度0.5～8 mg/mL范圍內(nèi)，比較4組虎杖多糖，還原力由大到小依次為:PCP－70＞PCP－90＞PCP－50＞PCP－30，PCP－70 還原力最強，PCP－30 最弱，且4組虎杖多糖的還原力均有較好的濃度依賴性，濃度越大，還原力越強，與DPPH自由基清除實驗所得結(jié)果相一致。在之前的報道中，楊軍國等［17］利用70%和80%乙醇沉淀制備的茶多糖中，TPs－70對DPPH清除活性及還原力均強于TPs－80，表明70%制備的多糖樣品抗氧化活性更高，與本研究結(jié)果相似。

2.6 虎杖多糖活性成分與抗氧化性的線性關(guān)系

圖4 虎杖多糖還原力Fig.4 Reducing power of polysaccharides from Polygonum cuspidatum

考察虎杖多糖有效成分對抗氧化性的影響，可通過SPSS軟件計算Pearson相關(guān)系數(shù)進行比較，Pearson相關(guān)系數(shù)越接近1，說明該成分與對應(yīng)的抗氧化活性相關(guān)性越高［7］。從表2可以看出，總糖及糖醛酸含量與DPPH自由基清除活性均有正相關(guān)性(y=0.132x－4.8417，r=0.880;y=0.2775x+1.6048，r=0.805)，總糖含量與還原力表現(xiàn)出正相關(guān)性(y=0.0012x－0.1863，r=0.740)，糖醛酸含量與還原力有顯著的正相關(guān)性(y=0.0035x－0.3002，r=0.945，p ＜0.05)。

表2 虎杖多糖總糖含量及糖醛酸含量與DPPH自由基清除活性及還原力的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 2 Pearson’s correlation coefficient of the contents of sugar and uronic acid in polysaccharides from Polygonum cuspidatum with the DPPH radical scavenging activity and reducing power

3 結(jié)論

本研究以虎杖為原料，采用乙醇分級沉淀法，制得4組虎杖多糖，分別為 PCP－30、PCP－50、PCP－70和PCP－90。其中PCP－30得率最高，PCP－70得率次之，PCP－70總糖含量及糖醛酸含量最高，且表現(xiàn)出最強的DPPH自由基清除活性及還原力，因此推測乙醇沉淀純化虎杖多糖的最適宜體系濃度為70%，在此條件下可簡單高效的實現(xiàn)虎杖多糖的初步提取純化，更易實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。紅外光譜檢測4組分都具有多糖的典型基團，且所含基團無明顯差異。相關(guān)性結(jié)果表明，虎杖多糖總糖及糖醛酸含量與其DPPH自由基清除活性及還原力活性之間呈正相關(guān)性。結(jié)果表明，乙醇分級沉淀是分離純化虎杖多糖簡單高效的方法，有利于提高虎杖的資源利用率，為其在藥品及保健食品中的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。