宣威火腿加工過程中抗氧化肽活性變化規律

邵靖萱，高曉格，王雅楠，楊子懿，邢路娟，周光宏，張萬剛

(南京農業大學肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇南京210095)

天然抗氧化劑主要是指從蔬菜和水果中提取出來的具有抗氧化活性的物質，它能幫助捕獲并中和自由基，從而抑制自由基對人體的損害。其因抗氧化能力相對較高、副作用小，且具有防腐保鮮作用而得到了廣泛關注［1－2］。因此，天然抗氧化劑的開發、研究和利用在食品加工工業領域有非常重要的意義。

天然抗氧化劑在自然界分布很廣泛，蔬菜、水果、谷物類、油料作物種子、豆科植物、飲料、可可產品、香辛料以及中草藥等［3］，均是人類可從飲食中攝取的主要的天然抗氧化劑的來源。近來在天然抗氧化劑的研究中發現，宣威火腿在加工成熟過程中會產生大量的由蛋白質和脂肪降解成的小分子風味物質［4］，其中肌肉蛋白質經內源酶降解后可形成不同分子質量大小的多肽片段，這些多肽不僅賦予火腿良好的感官風味，而且部分多肽具有抗氧化和抗高血壓的功效［5－6］。對于宣威火腿的研究，目前主要集中在風味物質的形成與鑒定、加工工藝的優化與標準化、加工過程中蛋白質和脂肪降解及菌落微生物的生成與測定等方面［7－9］，對其中可能含有的抗氧化活性物質等方面的研究還處于探索階段。

本實驗分別對加工前期(加工2個月)、中期(加工4個月)、后期(加工6個月)和加工成熟(加工8個月)的宣威火腿進行粗肽的提取，并以DPPH自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、羥基自由基清除率及總抗氧化能力的評價粗多肽的抗氧化活性。為進一步探究火腿加工過程中功能多肽的抗氧化活性變化規律，為火腿中粗肽的有效提取、合理開發和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

上鹽后未加工的宣威火腿以及加工時間分別為2、4、6、8個月的宣威火腿 均購于云南省宣威市浦記火腿食品有限公司;所選用的該公司宣威火腿的加工過程包括腌制、洗腿、晾曬、整形、發酵、干燥成熟等步驟，歷時8個月;1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH)、吩嗪甲酯硫酸鹽(PMS)、還原型輔酶(NADH) 上海源葉生物科技有限公司;還原型谷胱甘肽(GSH) 上海晶純生化科技股份有限公司;總抗氧化能力試劑盒 南京建成試劑公司;鄰苯二甲醛、十二烷基硫酸鈉(SDS)和β－巰基乙醇均 均為分析純，國藥集團化學試劑公司;胰酪蛋白胨 分析純，美國sigma公司;其他試劑 南京建成試劑公司，均為分析純。

GM200刀式研磨儀 德國Retsech公司;T25勻漿機 德國IKA公司;121550 PMMA冷凍干燥機 德國Christ公司;Spectral Max M2e多功能酶標儀 美國伯騰儀器有限公司;TW20水浴鍋 德國優萊博公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗肽粉的提取 參考邢路娟等［10］的方法并略做改進。取每個加工時期的各3條火腿的后腿肉，切成約1 cm3的火腿于3000 r/min離心并斬拌3次，每次10 s，稱取斬拌好的20 g火腿肉于100 mL 0.01 mol/L的鹽酸緩沖溶液中勻漿4次，每次10 s，轉速為16000 r/min，勻漿后于 4℃靜置 2 h，再于12000 r/min，－4℃轉速下離心20 min，取上清液加入3倍體積的40%(體積分數)乙醇溶液，于4℃靜止12 h后，再次于12000 r/min，－4℃下離心10 min，取上清液用45μm濾膜抽濾，抽濾后在－80℃冰箱中預凍12 h后用冷凍干燥機在－80℃下冷凍干燥，得到的粗肽粉保存在－20℃用于分析試驗。

1.2.2 粗肽含量的測定 參考Church等［11］的方法并稍作改進。取不同時期粗肽分別溶于水中配制1 mg/mL粗肽液，取100μL粗肽液與2 mL的鄰苯二甲醛混合溶液混合，室溫下避光精確反應2 min，于340 nm處測定紫外下吸光值。用胰酪蛋白胨作為標準物配制梯度溶液并測定吸光值，繪制標準曲線(y=0.7915x+0.0446，R2=0.9998，線性范圍為 0.2～1.0 mg/mL)以由此計算粗肽液中粗肽含量。

鄰苯二甲醛混合溶液配制:取80 mg的鄰苯二甲醛溶于2.0 mL甲醇溶液，依次加入50 mL 100 mmol/L硼砂(十水合四硼酸鈉)溶液、5.0 mL 20%質量分數的十二烷基硫酸鈉(SDS)和200μLβ－巰基乙醇，用去離子水調至總體積為100 mL。

1.2.3 DPPH自由基清除率的測定 參考Brandwilliams等［12］的方法并適當修改。取5個時期粗肽溶解于水中配制0.5 mg/mL的粗肽液，以相應質量濃度GSH作為對照。取0.5 mL的粗肽液，加入0.5 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液(體積分數為90%的乙醇配制)，充分混勻后于避光反應30 min。在517 nm下測量混合溶液吸光值，用90%乙醇代替粗肽液作為對照，0.5 mL 90%乙醇與0.5 mL去離子水混合作為空白。按照下面公式計算DPPH自由基清除率:

式中:A1為待測樣品吸光度;A2為對照樣品吸光度;A0為空白樣品吸光度。

1.2.4 超氧陰離子自由基清除率的測定 參考Sakanaka等［13］的方法并適當修改。取5個時期粗肽溶解于水中配制5 mg/mL的粗肽液，以相應質量濃度GSH作為對照。取1.5 mL的待測粗肽液，依次加入 0.5 mL 300 μmol/L NBT、0.3 mL 468 μmol/L NADH及0.5 mL 60μmol/L PMS，所有試劑及樣品用50 mmol/L p H8.0 Tris－HCl緩沖溶液配制，混勻后置于25℃水浴5 min，于560 nm波長下測定吸光值，以緩沖液代替樣品作為對照，按照下面公式計算超氧陰離子的清除率:

式中:A1為待測樣品吸光度;A2為對照樣品吸光度。

1.2.5 羥自由基清除率的測定 參考Zhu等［14］的方法并作適當修改。取5個時期粗肽溶解于水中配制5 mg/mL的粗肽液，以相應質量濃度GSH作為對照。取0.6 mL 5 mmo/L鄰二氮菲溶液加入0.4 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液，充分混勻后加入0.6 mL粗肽液及0.6 mL pH7.4的EDTA二鈉鹽，加入0.6 mL 5.0 mmol/L FeSO4溶液及 0.8 mL 0.1%H2O2，混勻后于37℃水浴，避光反應1 h后測定其在536 nm處的吸光值，以去離子水代替樣品作為損傷管，以去離子水代替H2O2作為未損傷管。按照下面公式計算粗肽液對羥自由基的清除率:

式中:A1為待測樣品吸光度;A2為未損傷樣品吸光度;A0為損傷樣品吸光度。

1.2.6 總抗氧化能力的測定 取5個時期粗肽溶解于水中配制5 mg/mL的粗肽液，以相應質量濃度GSH作為對照，按照總抗氧化能力(T－AOC)試劑盒的方法進行測定。

1.3 數據分析

統計分析采用SAS軟件完成，用方差分析中的線性模型來分析單因素加工時間對火腿中多肽的抗氧化活性影響，采用最小顯著差法(LSD)進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同加工時期宣威火腿多肽含量

由圖1可知，在加工過程中，宣威火腿中多肽的含量總體呈上升趨勢。未加工時的肽含量(1.58%)顯著低于加工2個月后的肽含量(3.65%)(p＜0.05)。加工2個月至6個月期間多肽含量呈現升高的趨勢，但三個加工時期之間多肽含量無顯著性差異(p＞0.05)。加工至8個月時，肽含量(6.26%)再次出現明顯提升，顯著高于6月的樣品(4.12%)(p＜0.05)，且極顯著高于未加工時的肽含量(p＜0.01)。本次實驗加工8個月樣品多肽含量(6.26%)為邢路娟等［10］用磷酸緩沖液提取的多肽含量的1.82倍，是Zhu等［14］用相似方法提取金華火腿粗肽的5.39倍。這可能是因為宣威火腿中的多肽含量高于金華火腿，且鹽酸提取法比磷酸提取法提取效率高。本實驗中未加工的火腿中也存在少量抗氧化活性多肽，這與Escudero等［15］豬肉中具有可抑制ACE活性多肽的研究結果相似。肽含量在0～2個月和6～8個月有顯著提升，這可能與火腿中內源蛋白酶的活性有關。加工0～2個月期間，火腿中的肌漿蛋白和肌原纖維蛋白先在內源蛋白酶(主要是組織蛋白酶和鈣蛋白酶［16］)的作用下水解為大分子量的多肽［17］，隨后在蛋白酶的作用下(如二肽基肽酶［18］)使多肽分子的氨基末端的小分子多肽以及游離氨基酸釋放。Zhou［19］等在金華火腿的研究中發現，加工6～8個月期間，火腿中組織蛋白酶L的活性較之前有明顯提升，該酶具有將火腿中不溶性蛋白水解為可溶性蛋白，可溶性蛋白水解為多肽的重要作用。宣威火腿的加工過程中可能存在類似機理，使得肽含量在該階段顯著提升。

圖1 宣威火腿在加工過程中多肽含量變化Fig.1 The peptide content changes of Xuanwei ham during processing注:不同小寫字母表示差異顯著(p＜0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(p＞0.05)。不同大寫字母表示差異極顯著(p＜0.01)，相同大寫字母表示差異不極顯著(p＞0.01)。

2.2 不同加工時期宣威火腿粗肽液清除DPPH自由基能力

由圖2可知，宣威火腿粗肽液在加工過程中具有較好的清除DPPH自由基的能力，且總體呈上升趨勢，但始終顯著低于同濃度的谷胱甘肽(GSH)(p＜0.05)。在加工前4個月，清除能力變化不顯著(p＞0.05)。加工6個月時，清除率較之前有顯著提高(p＜0.05)。而6個月之后DPPH清除能力趨于穩定，8月(18.84%)與6月(19.00%)之間無顯著性差異(p＞0.05)。本實驗宣威火腿DPPH自由基清除率與鄭錦曉等［17］報道的金華火腿DPPH自由基清除率相近(均在20%左右)，但是卻低于邢路娟等［10］測定的宣威火腿粗肽DPPH自由基清除率(約為60%)。結果不一致主要是因為火腿樣品的加工時間存在差異，邢路娟實驗所用火腿為加工成熟后16個月的樣品，即使在加工成熟后，火腿蛋白質仍會發生進一步的降解，產生更多具有抗氧化活性的多肽，使粗肽DPPH清除能力增強。楊小幸等［20］在蘋果酵素天然加工過程中觀察到類似現象，DPPH自由基清除率呈先升后降趨勢。粗肽液中含有暴露的氨基酸側鏈基團，對DPPH可以產生親和能力。同時，不同加工階段的降解產生的肽序列有所不同，這也可能導致清除能力的變化［21］。Leticia 等［22］研究發現，在加工成熟西班牙干腌火腿中，抗氧化活性最高的多肽氨基酸序列為Ser－Asn－Ala－Ala－Cys，而 Asp－Leu－Glu－ Glu 為加工成熟后宣威火腿中主要的抗氧化肽片段［23］。

圖2 宣威火腿粗肽液DPPH自由基的清除率Fig.2 The scavenging effect of crude peptides from Xuanwei ham on DPPH radical注:不同小寫字母表示不同加工時期粗肽液間差異顯著(p＜0.05);圖3～圖5同。

2.3 不同加工時期宣威火腿粗肽液清除超氧陰離子自由基能力

由圖3可知，隨著加工時間的延長，宣威火腿粗肽液清除超氧陰離子自由基能力有所增強，且始終顯著高于同濃度GSH(p＜0.05)。加工前2個月，清除率有明顯的提升，加工2個月后的樣品自由基清除率(87.80%)顯著高于未加工(82.01%)樣品加工(p＜0.05)。從2月至6月，清除能力基本保持穩定。加工6個月后，清除能力再次出現較為明顯的提高，但變化幅度小于最初2個月，其中8月(87.33%)自由基清除率顯著高于6月(90.52%)(p＜0.05)。邢路娟等［10］對宣威火腿的研究表明，同等質量濃度下，宣威火腿粗肽液清除超氧自由基能力極顯著高于GSH(p＜0.01)，與本研究結果一致。清除能力在兩個階段出現明顯變化，這與宣威火腿不同加工時期多肽含量的變化趨勢相一致。祝超智等［28］對金華火腿的研究表明，抗氧化活性的高低與肽鏈長短也有密切關系，分子量小的肽段具有更強的生物活性。由于大分子肽在發酵過程中不斷降解，加工6～8個月內具有抗氧化活性的小分子肽含量可能大幅提升。肽鏈變短，某些特定基團也具有更多的暴露機會，如具有清除能力的酚羥基團［15］。該基團可以提供氫離子，中止活性氧的鏈反應，起到清除超氧陰離子自由基的作用。

圖3 宣威火腿粗肽液對超氧陰離子自由基的清除效果Fig.3 The scavening effect of crude peptides from Xuanwei ham on superoxide radical

2.4 不同加工時期宣威火腿粗肽液清除羥基自由基能力

羥基自由基是由體內Fenton反應產生的氧化活性最強的自由基，在生理和病理學研究中具有重要意義［25］。由圖4可知，宣威火腿粗肽液清除羥基自由基的能力隨著加工時間的延長穩步提升。加工最初2個月清除率升高速度最快，提高了13.36%。之后升高速度逐漸趨于緩慢，于加工8個月后達到最高值35.35%。原料肉粗肽液的清除能力與同濃度GSH相差31.63%，有顯著差異(p＜0.05)，加工8個月后，兩者之間的差異縮小為7.54%。本實驗研究中，火腿粗肽的清除能力受加工時期影響變化最大，說明長時間加工可顯著提高火腿中粗肽清除羥自由基的能力。但是加工8個月后的粗肽清除羥自由基的能力小于金華火腿中粗肽的清除能力［14］，可能是不同火腿中清除羥自由基的特異性多肽種類或含量不同。范遠景等［26］在花生肽的研究中發現，多肽的氨基酸組成和種類對其清除羥基自由基的能力有顯著影響。含有Tyr和His等氨基酸的多肽具有較強的抗氧化能力。Tyr是一個潛在的供氫體，His的咪唑基可以有效清除脂游離基和螯合金屬離子。隨著加工時間的增長，新降解產生的短肽可能含有更多此類氨基酸，從而能更有效地終止羥基自由基的鏈反應，起到清除作用。

圖4 宣威火腿粗肽液對羥基自由基的清除效果Fig.4 The scavenging effect of crude peptides from Xuanwei ham on hydroxyl radical

2.5 不同加工時期宣威火腿粗肽液總抗氧化能力變化

總抗氧化能力可以全面地反應機體防御系統的抗氧化能力［27］，本文用 ABTS快速法，以 Trolox標準液做參比，衡量樣品總抗氧化活性。由圖5可知，宣威火腿粗肽液的總抗氧化能力總體呈上升趨勢，但始終顯著低于同濃度GSH(p＜0.05)，與鄭錦曉等［17］的實驗結果相似，與不同加工時期多肽含量變化趨勢相同，加工最初2個月與最后2個月出現了更為顯著的變化。從開始加工到加工2個月，總抗氧化能力差異顯著(p＜0.05)，由4.20 U提升至4.35 U。之后4個月處于相對穩定狀態，三個時間點之間無顯著性差異(p＞0.05)。從6月到8月，總抗氧化能力再次出現顯著增長，最終在加工8個月達到最大值4.41U(p＜0.05)。郭利娜等［28］對枯草芽孢桿菌發酵小米糠抗氧化活性的研究發現，在一定時間范圍內，隨著發酵時間的延長，蛋白酶活力與總抗氧化能力顯著相關。因此，粗肽液抗氧化能力的變化可能與加工過程中蛋白酶活力的變化相關，火腿中的蛋白質不斷被水解成具有抗氧化活性的多肽，總抗氧化能力隨之提升。

圖5 宣威火腿粗肽液的總抗氧化能力Fig.5 The total antioxidant capacity(T－AOC)of crude peptides from Xuanwei ham

3 結論

本實驗探究了宣威火腿加工過程中多肽含量的變化，運用多個指標對宣威火腿中多肽在不同加工時期的抗氧化活性進行評價。隨著加工時間的不斷增長，宣威火腿中多肽的含量，多肽液清除DPPH自由基能力，清除超氧陰離子自由基能力，清除羥基自由基能力和總抗氧化能力與加工前相比均有不同程度提高，可見長時間加工可以提高火腿中多肽含量和抗氧化能力。同時，宣威火腿對不同自由基的清除效果有較大差異，其中以清除超氧陰離子自由基的效果最為顯著，具有成為天然抗氧化劑的應用潛力。本實驗結果為火腿中粗肽的有效提取、開發和應用提供了理論依據，為干腌火腿產品營養品質特性提供了參考。