一株黃曲霉毒素B1降解菌的篩選及鑒定

王明清，張初署，于麗娜，顧 博，丁 昱，畢 潔，孫 杰，遲曉元，張建成，龔魁杰，楊慶利

(1.山東省花生研究所，山東青島266100;2.西海岸現代農業示范區管委會，山東青島266000;3.山東省農業科學院作物研究所，山東濟南250000;4.青島農業大學食品科學與工程學院，山東青島266109)

黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是黃曲霉和寄生曲霉等真菌產生的一類次級代謝產物［1－2］。從分子結構上分析，該類毒素是由二呋喃環和香豆素組成的結構類似物［3］。黃曲霉毒素具有極強的致畸、致癌、致突變性，廣泛污染花生、玉米、棉籽、稻谷等農產品，其毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，對人、禽和獸類的健康造成極大威脅［4－6］。根據紫外線照射下發出的熒光顏色區分，已報道黃曲霉毒素主要分為B類和G類，B類包括B1和B2，G類包括G1和G2;此外，還包括一些衍生物，如黃曲霉毒素M1、M2等，其中黃曲霉毒素B1(AFB1)污染最廣，并且毒性最強，危害最大［7－8］。因此，尋找能有效脫除農產品中AFB1的方法對污染糧食再利用，以及保障人和動物健康具有重要的意義。

目前常用的脫除AFB1方法主要是物理法和化學法。物理法包括有挑揀、漂洗、高溫加熱、輻射法、溶劑萃取等方法［9－10］，這些方法或者耗費大量人力物力，脫除效率不高，或者會破壞農產品的營養成分。化學法是利用一些氧化劑、氫氧化鈉等化學試劑與毒素反應造成毒素降低［11－12］，但有很大的局限性，很多試劑對操作人員的皮膚、眼睛、呼吸道造成傷害，并且化學試劑殘留不易去除，影響農產品和食品的質量安全。近些年來，生物降解AFB1引起了研究人員的越來越多的關注，原因是生物脫毒法既避免了理化方法破壞農產品和食品的營養的弊端，又具有降解條件溫和、特異性強和脫毒效率高等優點［13］。現在已發現有些細菌和真菌能降解AFB1，細菌類的降解菌如分支桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌等［14－16］，真菌類的降解菌如假蜜環菌、黑曲霉、黑芝等［13，17］。目前對微生物降解AFB1的大部分研究還處于菌株篩選階段，篩選能高效降解AFB1的菌株是開展生物降解的重要基礎。

本研究通過初篩和復篩從土壤中分離了一株高效降解AFB1的菌株A6;通過細菌形態學觀察、生理生化特征以及16SrRNA基因分析鑒定菌株A6;進一步分離菌株的上清液、菌懸液和胞內液，通過分析各組分降解AFB1的效率，初步確定起降解作用的活性物質的所在組分。本研究為進一步研究其降解機理和應用生物脫毒提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土壤樣品 采自山東省青島市黃島區;AFB1標品 Fermentek公司;香豆素 上海融禾醫藥科技發展有限公司;色譜級甲醇 Merck公司;細菌基因組DNA提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒 天根公司;黃曲霉毒素免疫親和柱 華安麥科公司;Super GelRed熒光染色試劑 US Everbright Inc;p MD19－T載體 大連寶生物公司。

初篩培養基為香豆素液體篩選培養基［11］(g/L):0.25 g KH2PO4，0.25 g MgSO4·7H2O，0.5 g KNO3，0.5 g(NH4)2SO4，0.005 g CaCl2，0.003 g FeCl3·6H2O，1.0 g香豆素，pH7.0，121℃高壓滅菌15 min。香豆素固體篩選培養基:在液體培養基的基礎上加入15 g/L瓊脂。復篩培養基(g/L):10 g蛋白胨，3 g牛肉膏，10 g NaCl，1 g KH2PO4，1 g 葡萄糖，pH7.0，121 ℃ 高壓滅菌15 min。LB液體培養基(g/L):10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，pH7.0，121 ℃ 高壓滅菌15 min。LB固體培養基:LB液體培養基中加入15 g/L瓊脂。

IS－RDV1恒溫振蕩器 美國精騏公司;5430R高速離心機 德國Eppendorf公司;S1000TM Thermal Cycler PCR儀和凝膠成像儀 美國BIO－RAD公司;p H計 賽多利斯公司;GI36T高壓蒸氣滅菌器 致微(廈門)儀器有限公司;1260型高效液相色譜儀 Agilent公司。

1.2 實驗方法

X1代表空白對照樣品AFB1的峰面積，X2代表發酵菌液處理樣品中殘留AFB1的峰面積，Y代表AFB1降解率。

1.2.4 菌株A6降解特性研究 參考文獻［11］和［20］的方法，全部在無菌環境下操作。5 mL的菌株A6發酵液，4℃條件下8000 r/min離心10 min，分離得到上清液和菌體。菌體用無菌蒸餾水洗滌、離心，重復3次后加入無菌蒸餾水補齊至5 mL，制備成A6菌懸液。按上述方法制備5 mL菌懸液，然后在冰上超聲(超聲破碎2 s，停4 s)破碎20 min后離心，收集的液體經0.22μm濾膜過濾制備A6的胞內液。取

1.2.1 降解AFB1菌株的初篩 采集的土壤樣品以無菌水稀釋10倍，稀釋液按1/100接種量接種到初篩培養基，以香豆素為唯一碳源和能源［18］，進行AFB1降解菌株的初篩，200 r/min 37℃振蕩培養2～3周。觀察菌株的生長情況，當培養基出現渾濁后在初篩的固體培養基涂布，在37℃培養箱中培養。觀察細菌生長情況，根據菌落形態、顏色等挑取單菌落，在LB固體培養基上多次劃線純化培養。純化的菌株培養后，加入15%甘油，－80℃冰箱保存。

1.2.2 降解AFB1菌株的復篩 初篩菌株接種于復篩培養基，37℃培養48 h。避光條件下，980μL發酵菌液加入20μL 5 mg/kg的AFB1標準品，使發酵液中AFB1終濃度為100μg/kg，無菌復篩培養基作為空白對照，37℃避光孵育72 h［19］，采用高效液相色譜(HPLC)檢測AFB1的含量，獲AFB1降解率最高的一株菌。

1.2.3 AFB1含量的檢測 參考文獻［16］的測定方法。收集1.2.2中的樣品，8 000 r/min離心20 min，上清液經0.22μm濾膜過濾后過免疫親和柱，先用超純水洗兩遍，然后用色譜級甲醇洗脫，收集洗脫液。采用HPLC檢測溶液中AFB1的含量，HPLC檢測條件為:Agilent 1260高效液相色譜儀，C－18色譜柱(4.6 mm×15 cm ×5 μm)，進樣量為20μL，流動相為甲醇∶水 =1∶1(V/V)，流速 0.8 mL/min，熒光檢測器激發波長為360 nm，發射波長為440 nm。利用以下公式計算菌株對AFB1的降解率:A6上清液、菌懸液、胞內液各 980μL，分別加入20μL 5 mg/kg的 AFB1標準品，使 AFB1終濃度為100μg/kg，在37℃孵育72 h后，檢測各組分AFB1降解率。

1.2.5 菌株鑒定

1.2.5.1 表型分析 菌株A6在LB固體培養基平板上37℃培養24 h后觀察菌落形態、色澤。

1.2.5.2 生理生化性質分析 觀察菌株A6革蘭氏染色反應［21］，將菌株A6接種在LB固體平板，放置在不同溫度培養，研究其溫度耐受性［22］;將菌株A6接種在LB液體培養基中，調整其中NaCl的濃度，研究其鹽度耐受性［22］。唯一碳源利用試驗:將1.1中初篩培養基的香豆素替換為某一底物碳源，115℃滅菌20 min，將菌株A6在唯一碳源平板上劃線，37℃培養15 d，觀察是否生長，碳源包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、吐溫－20和吐溫－80等碳源。氧化酶試驗［23］:用1%四甲基對苯二胺二鹽酸鹽溶液浸濕濾紙，挑取新鮮的菌株A6點在濾紙上，在10 s內呈現紫色的為陽性。過氧化氫酶試驗［23］:將30%過氧化氫滴在新鮮的A6菌落上，如果立即出現氣泡為陽性，30 s后仍未產生氣泡為陰性。

1.2.5.3 細菌16S rRNA基因序列測定 菌株A6接種到LB液體培養基，37℃振蕩培養24 h后，采用細菌基因組提取試劑盒提取細菌基因組DNA。采用的細菌16S rRNA基因通用引物為:P1:5'－AGAGTTT GATCCTGGCTCAG－3'，P2:5'－ GGTTACCTTGTTACG ACTT－ 3'［24］。PCR 的 反應 體系 25 μL:Taq buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，Taq聚合酶0.1 μL，引物P1和 P2各1 μL，A6菌株基因組模板 0.5 μL，ddH2O 17.9 μL。PCR擴增程序:95℃預變性5 min;95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環;72℃延伸5 min。反應結束后，5μL PCR產物上樣于1%瓊脂糖凝膠，90 V電壓電泳25 min后經凝膠成像系統檢測結果，PCR產物經過切膠、純化等操作送到到上海生工生物有限公司測序。測序得到的序列提交到NCBI進行BLAST分析，將目標序列與搜索到的同源序列經ClustalW分析后，再用MEGA6軟件構建系統進化樹。

1.3 數據處理

各實驗重復3次，取平均值作為結果，顯著性采用SPASS 17.0軟件分析。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

以香豆素為唯一碳源進行初篩，然后以加入AFB1的培養基進行復篩，篩選到多株能降解AFB1的菌株，其中菌株 S1、S4、A6、L2、L5 的 AFB1的降解率超過50%(圖1)，分析結果表明菌株A6的降解效率顯著高于其它四株菌，該菌在37℃孵育72 h能降解90.6%的AFB1。后面實驗圍繞著菌株A6進行研究，分析該菌株的降解特征并對其進行鑒定。

2.2 菌株A6降解特性

圖1 各菌株降解AFB1的能力Fig.1 Degradation of AFB1 in each strain注:不同字母代表具有顯著性差異p＜0.05;圖2同。

圖2 為菌株A6各組分降解AFB1特性。比較菌株A6的上清液、菌懸液、胞內液降解AFB1的能力，發現上清液降解能力最強，達到90.6%，菌懸液和胞內液顯著降低(p＜0.05)，分別為19.6%和12.8%。由此判斷，菌株A6降解AFB1不是依賴細菌胞體的吸附作用，而是細菌代謝產生并分泌至胞外的活性物質主導的生物降解作用。

圖2 菌株A6各組分降解AFB1能力Fig.2 Degradation of AFB1 in each component of strain A6

2.3 菌種鑒定

2.3.1 菌株A6形態學特征 由圖3菌株A6的菌落形態可以看出，菌株A6在LB培養基上單菌落呈現圓形凸起，顏色為乳白色，具有皺褶，直徑為5～8 mm，并且具有粘稠的特征。

圖3 菌株A6的菌落形態Fig.3 The colony morphology of strain A6

2.3.2 菌株A6生理生化特征 菌株A6的革蘭氏染色呈陽性，能利用葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、乳糖、麥芽糖、淀粉、甘露糖等碳源，不能利用吐溫－20、吐溫－80、檸檬酸鹽、半乳糖、蜜二糖等碳源，具有氧化酶和過氧化酶活性，能耐受10%的鹽度，能在10～45℃范圍內生長(表1)，該生理生化特征與 Bacillus velezensis CR－502T相似［25］。根據菌株 A6 的生化反應特征及形態學特征［25］，初步判斷菌株A6屬于芽孢桿菌屬。

表1 菌株A6的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of stain A6

2.3.3 菌株A6的16SrRNA基因鑒定 以16SrRNA基因特異性引物進行PCR擴增，在1000～2000 bp之間獲得一條特異性的擴增條帶，且條帶清晰亮度好(圖4)。該條帶經切膠、純化等操作，測序得到16S rRNA基因長度為1431 bp，該序列已提交GeneBank，登錄號為MH156042。與已經公布的序列比對分析，發現菌株A6與芽孢桿菌屬的菌株處于同一大的分支(圖5)，其中與貝萊斯芽孢桿菌CR－502T(Bacillus velezensis)聚類在一起，進化距離最近，相似度為99.64%。結合形態、生理生化和16S rRNA基因分析結果鑒定菌株A6為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)，命名為 Bacillus velezensis A6。

3 討論

圖4 菌A6的16SrRNA基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.4 Electrophoresis profile of 16SrRNA gene from srain A6 by PCR注:M是DL2000 DNA Marker，1是菌株A6的16SrRNA基因。

有關AFB1降解菌的篩選已有較多報道，研究發現有些乳酸菌、酵母菌等微生物脫除AFB1的機理是吸附作用，這些微生物的菌體吸附 AFB1形成菌體－毒素復合物［26］，該菌體－毒素復合物可以減少生物體對AFB1的吸收和代謝作用，然而這種毒素的吸附與釋放是可逆的，當生物體內環境發生變化后可能會再次釋放到機體中，因而這種吸附作用沒有實現黃曲霉毒素去除的目的［27］。本研究從土壤中分離的A6菌株能有效去除AFB1，進一步研究分析了菌株A6的上清液、菌懸液、胞內液降解AFB1能力，發現細菌分泌胞外的活性物質能高效降解AFB1，排除了細菌菌體對AFB1的吸附作用。孫玲玉等［20］發現一株泰山枯草芽孢桿菌，該菌的上清液、菌懸液和胞內液能分別降解81.2%、16.1%、2.3%的AFB1。關心等［11］以香豆素為唯一培養基，從雞糞中分離出一株蔬菜芽孢桿菌F6，該菌的上清液、菌懸液和胞內液能分別降解83%、22.8%、17.4%的AFB1。雷元培等［28］分離發現的枯草芽孢桿菌060的上清液能降解73%的AFB1，而菌懸液和胞內液對AFB1的降解率僅為10%左右，表明該菌對AFB1降解的活性物質是一種胞外分泌物，主要存在于上清液中。本研究篩選到的貝萊斯芽孢桿菌A6的上清液、菌懸液和胞內液能分別降解90.6%、19.6%、12.8%的AFB1，降解特征與已報道的泰山枯草芽孢桿菌、蔬菜芽孢桿菌F6、枯草芽孢桿菌060相似。在今后分離純化貝萊斯芽孢桿菌A6降解AFB1的胞外活性物質時，排除了細胞菌體和胞內產物對生物工程下游處理帶來的不便和復雜程序。

圖5 菌株A6的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain A6注:菌株后面括弧是該菌與菌株A6的16SrRNA基因的相似度。

4 結論

本研究從青島土壤中篩選出的菌株A6能高效降解AFB1，進一步研究發現起降解的活性物質主要位于細菌胞外液。根據細菌生物形態學觀察、生理生化特征以及16S rRNA基因分析鑒定菌株A6為貝萊斯芽孢桿菌，命名為Bacillus velezensis A6。這些研究結果為進一步深入研究該菌的降解機理及應用于AFB1脫毒奠定了基礎。