spoIIE基因缺失對克勞氏芽孢桿菌淀粉酶酶活的影響

張 虎，肖 靜，原梨萍，汪俊卿，王瑞明

(齊魯工業大學(山東省科學院)生物工程學院，生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室，山東濟南250353)

克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)是一株產芽孢革蘭氏陽性菌株，其能夠產生多種酶，主要有堿性蛋白酶、淀粉酶等［1］。尤其在產淀粉酶時，該菌在進入穩定期后，開始形成芽孢，芽孢形成后在發酵產酶過程中將嚴重影響目標酶活及產量［2－4］。因此通過了解芽孢桿菌芽孢形成機制［5－8］，以及芽孢的形成對B.clausii QL－1淀粉酶產量的影響，而使該菌株喪失或降低芽孢生成能力，這將在一定程度上有利于淀粉酶酶活及產量的提高。

目前國內外多以枯草芽孢桿菌為模式菌株，對芽孢形成機制及關鍵基因進行了大量研究［9－10］，而至今并未見有對克勞氏芽孢桿菌，芽孢形成以及芽孢的形成機制對于該菌發酵產酶方面研究的報道。對于枯草芽孢桿菌相關研究表明芽孢形成主要分為8個階段，每個階段需要多個基因共同調控［11－12］，并且目前國內外，對芽孢形成相關基因的研究多集中在spo0A 及 sigma 因子［13－14］，而對其它芽孢形成相關基因研究甚少，而在枯草芽孢桿菌中研究表明spoIIE基因為芽孢形成第二階段關鍵調控基因，它的編碼產物為蛋白磷酸酶，它能夠保持前芽孢中重要的σF因子的活性，從而保證芽孢的形成順利的向下一個階段過渡，同時它在前芽孢和母細胞不對稱分裂及基因的不對稱分布過程中發揮重要作用［15－16］。并且目前對芽孢基因研究的菌種范圍較狹窄，多局限于對芽孢的形成及菌體生長方面的影響，而對于菌體發酵產物的影響研究較少。

目前國內外對芽孢桿菌淀粉酶產量方面的研究，多集中在培養基、工藝參數以及淀粉酶基因克隆的外源表達［17－18］，并未見從芽孢形成相關基因方面入手，研究其對菌株淀粉酶產量影響的報道。但是相關文獻已有報道，枯草芽孢桿菌spo0A基因缺失菌株會影響胞外蛋白酶的產量［19］，因此，針對以上對芽孢形成相關的基因研究的局限性，本文從目前相關研究甚少的芽孢形成關鍵基因spoIIE入手，通過構建B.clausii QL－1ΔspoIIE菌株，研究該基因對 B.clausii QL－1芽孢形成、發酵產α－淀粉酶以及通過初步補料發酵芽孢缺失型菌株的高密度連續發酵對生物量的影響。這對于高產α－淀粉酶芽孢桿菌類工業生產菌株的構建具有一定的借鑒意義，對于芽孢形成相關基因spoIIE的功能得到進一步了解。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

克勞氏芽孢桿菌(B.clausii QL－1) 野生菌株;pHT01質粒 用于Cmr片段的擴增，均由山東省微生物工程重點實驗室保藏;引物 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;LB培養基 用于克勞氏芽孢桿菌的培養;發酵培養基(可溶性淀粉20 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉20 g/L、Na2HPO420.66 g/L、NaH2PO46.6 g/L);補料培養基同發酵培養基;可溶性淀粉培養基固體:牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L、可溶性淀粉2 g/L、瓊脂20 g/L;GM(菌體增殖培養基) 酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、山梨醇91 g/L;ETM(電轉緩沖液)山梨醇91 g/L、甘露醇91 g/L、甘油100 g/L;RM(菌體復蘇培養基)酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、山梨醇69 g/L、甘露醇91 g/L;限制性內切酶 寶生物工程(大連)有限公司;高純度質粒小量快速抽提試劑盒 艾德萊生物技術有限公司;Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒 生工生物工程(上海)股份有限公司。

ZQZY－CS恒溫振蕩培養箱 上海知楚有限公司;GNP－9080型隔水式恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;Centrifuge 5804R低溫冷凍離心機、4380型電轉儀德國 Eppendorf公司;Veriti96孔熱循環梯度PCR儀 美國應用生物系統公司;MD2000H核酸超微量分光光度計 美國BioFure公司;UVI Essential V6凝膠成像儀 英國Uvitec公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計 spoIIE基因擴增引物spoIIE F1/spoIIE R1，Cmr基因擴增引物 CmrF2/CmrR2，引物序列見表1。

表1 本研究所用引物及序列Table 1 Primers and sequences used in the study

1.2.2 同源重組片段spoIIE－Cmr的制備 使用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒提取B.clausii QL－1菌體基因組，使用高純度質粒小量提取試劑盒提取p HT01質粒，以 B.clausii QL－1菌體基因組為模板spoIIE F1與spoIIE R1為引物PCR擴增獲得spoIIE片段;以pHT01質粒為模板，CmrF2和CmrR2為引物PCR擴增獲得Cmr片段，以上擴增條件為:95℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min 20 s(spoIIE 片段)，2 min 30 s(Cmr片段)30個循環;72℃延伸10 min，4℃保存;使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，對以上兩個片段膠回收后，以spoIIE及Cmr為模板進行重疊延伸PCR，獲得同源重組片段spoIIE－CmrR，擴增分兩步條件為:95℃預變性5 min;95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min 30 s，5個循環;72℃延伸5 min95℃預變性5 min;95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸3 min 30 s，30個循環;72℃延伸10 min，4℃保存，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收所得的spoIIE－Cmr片段，－20 ℃保存。

1.2.3 同源重組片段spoIIE－Cmr回收產物的酶切及濃縮 將1.2.2所得的spoIIE－Cmr同源重組片段制備成20μL的酶切體系:1μL限制性內切酶Bam HⅠ，2 μL 10×Fast Digest Buffer，spoIIE－Cmr同源重組片段添加1μg，最后用 dd H2O將酶切體系補充到20μL，37℃酶切1 h;向酶切后的產物中，加入1/10體積3 mol/L醋酸鈉溶液和2.5倍體積的無水乙醇，－20℃條件下放置20 min，12000 r/min離心5 min得DNA沉淀;加入70%乙醇重懸 DNA沉淀，12000 r/min離心5 min除去乙醇，37℃風干，加入25 μL ddH2O重懸，制得500 ng/μL的spoIIE－Cmr濃縮DNA溶液。

1.2.4 克勞氏芽孢桿菌B.clausii QL－1感受態的制備

甘油管挑取一接種環B.clausii QL－1菌液劃線于LB平板，37℃培養18 h，反復活化兩代，挑取二代平板上的單菌落接種于15 mL的LB培養基，37℃、200 r/min培養12 h;將菌液轉接于50 mL菌體增殖培養基中，使初始菌液OD600=0.15，37℃、200 r/min培養至OD600=0.95;將菌液倒入預冷的50 mL離心管中，10 min，4 ℃，5000 r/mim 離心 10 min，收集菌體;用預冷的20 mL電轉緩沖液洗滌3次后，重懸、分裝，即為制備好的感受態細胞［20］，－80℃保存。

1.2.5 同源重組片段spoIIE－Cmr的電轉化、陽性重組菌株的鑒定及遺傳穩定性驗證 將制備的B.clausii QL－1感受態細胞與spoIIE－Cmr濃縮重組片段于冰上以10∶1比例輕輕吹打混勻，將混合物移入2 mm 電轉杯，冰浴3 min，1500 V、5 ms電轉，電轉結束后，立即加入1 mL的菌體復蘇培養基，37℃，180 r/min復蘇4 h后涂布于含氯霉素(25μg/mL)的LB固體培養基中培養18 h左右，篩選抗氯霉素菌株，以提取到的陽性菌株基因組 DNA為模板，spoIIE F1和CmrR2為引物進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，最終獲得陽性重組菌株B.clausii QL－1 ΔspoIIE;將B.clausii QL－1ΔspoIIE重組菌于LB液體培養基中，37℃、200 r/min傳代15次，進行菌落PCR擴增驗證擴增條件參見1.2.2中重疊延伸PCR第二步條件。

1.2.6 B.clausii QL－1ΔspoIIE重組菌芽孢形成檢測 B.clausii QL－1與 B.clausii QL－1ΔspoIIE菌株分別以2%接種量接種于 LB液體培養基，37℃、200 r/min培養28 h，菌液于80℃水浴處理10 min，將未處理的菌液與處理的菌液分別稀釋適當倍數涂布于LB固體平板上，37℃培養18 h，平板計數法記錄并計算芽孢生成率，產芽孢率(%)=芽孢數/(芽孢數+營養細胞數)×100。

1.2.7 B.clausii QL－1與 B.clausii QL－1ΔspoIIE 生長周期及菌體干重的測定 挑取B.clausii QL－1與B.clausii QL－1ΔspoIIE單菌落于15 mL LB液體培養基，37℃、200 r/min培養12 h，將菌液轉接至100 mL LB液體培養基至初始 OD600=0.1左右，37℃、200 r/min培養，每隔4 h取樣，在600 nm波長下測定菌體濃度。每隔12 h取樣10 mL，離心得菌體沉淀，于70℃恒溫干燥箱干燥至恒重后測其干重。

1.2.8 B.clausii QL－1 與 B.clausii QL－1ΔspoIIEα－淀粉酶酶活測定 分別將出發菌株B.clausii QL－1和重組菌株B.clausii QL－1ΔspoIIE單菌落點涂于淀粉平板中央，于37℃培養，滴加碘液觀察并測量透明圈大小。分別以2%接種量接種于發酵培養基，37℃、200 r/min培養，每隔6 h取樣，4℃、12000 r/min離心8 min取上清，按照國標GB/T 24401－2009所示方法測定淀粉酶酶活，按菌體干重換算為U·g－1。

酶活定義:于60℃，pH6.0條件下，1 h液化1 g可溶性淀粉，即為一個酶活力單位(U·mL－1)。

1.2.9 B.clausii QL－1ΔspoIIE補料與未補料發酵對比

將B.clausii QL－1ΔspoIIE菌液以2%接種量轉接至兩瓶1 L發酵培養基，加入初始濃度為25 mg/mL的氯霉素1 mL，37℃，200 r/min培養至30 h，對其中之一的培養基開始補加15 mL補料培養基，每隔6 h補加一次，培養過程中不同時間段對補料與未補料的發酵液進行取樣測OD600、菌體干重及α－淀粉酶酶活。

1.3 數據處理

本文中引物設計采用Oligo 7設計，實驗采用三次重復，數據由Execl處理，Origin 8繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 spoIIE－Cmr重組片段的構建

以B.clausii QL－1出發菌株基因組為模板，spoIIE F1和spoIIE R1為引物進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1(a)，成功獲得791 bp的spoIIE片段;以質粒 p HT01為模板，CmrF2和CmrR2為引物PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1(b)，成功獲得1259 bp的Cmr片段;以膠回收所得的spoIIE片段和Cmr片段為模板，spoIIE F1和CmrR2為引物重疊延伸PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1(c)，于2000 bp左右出現特異性條帶，與理論長度2028 bp相符，成功獲得同源重組片段 spoIIE－Cmr。

圖1 spoIIE、Cmr spoIIE－cmr片段PCR擴增驗證電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplified and colonyPCR vertification products of spoIIE，Cmr，spoIIE－cmr注:a:M為 DL5000 Marker;1～4泳道為 spoIIE片段，長791bp;b:M為DL5000 Marker;1～4泳道為Cmr片段，長1259 bp;c:M為DL5000 Marker;1～4泳道為重疊片段spoIIE－Cmr，長 2028 bp。

2.2 重組菌株的篩選及遺傳穩定性驗證

將spoIIE－Cmr片段經Bam HⅠ單酶切后進行濃縮，測其濃度為528 ng/μL，利用電穿孔轉化法將spoIIE－Cmr片段導入 B.clausii QL－1，37 ℃過夜培養，Cmr抗性平板長出的單菌落即為成功發生整合的轉化子，挑取轉化子繼續傳代培養，菌落PCR驗證，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖2，同樣于2000 bp附近出現特異性目的條帶，表明成功獲得遺傳穩定性較好的重組菌株B.clausii QL－1ΔspoIIE。

圖2 B.clausii QL－1ΔspoIIE重組菌株遺傳穩定性菌落PCR擴增驗證電泳圖Fig.2 Genetic stability colony PCR vertification of B.clausii QL－1ΔspoIIE注:M為DL5000 Marker;1～4泳道為傳代10次后B.clausii QL－1ΔspoIIE菌落PCR擴增驗證spoIIE－Cmr條帶，長2028 bp。

2.3 spoIIE基因對芽孢萌發及菌體干重的影響

通過平板計數法對出發菌株及重組菌株芽孢萌發情況進行比較，結果見圖3，B.clausii QL－1芽孢萌發數為3.93×108CFU·mL－1，B.clausii QL－1 菌體數為 4.67 ×108CFU·mL－1，計算得到出發菌株 B.clausii QL－1 芽孢生成率為 84.15%，B.clausii QL－1ΔspoIIE芽孢萌發數為 2.53 ×106CFU·mL－1，B.clausii QL－1 ΔspoIIE菌體數為 5.4 ×108CFU·mL－1，通過計算得B.clausii QL－1ΔspoIIE芽孢生成率為0.48%。通過對B.clausii QL－1spoIIE基因敲除，芽孢生成率明顯降低且菌體數得到極大提高，說明spoIIE基因在克勞氏芽孢桿菌芽孢形成和菌體生長中起到重要作用。為進一步比較出發菌株及spoIIE基因缺失菌株生物量變化程度，對出發菌株B.clausii QL－1及重組菌株B.clausii QL－1ΔspoIIE進行了生長曲線及干重測定，結果見圖4與圖5，重組菌株 B.clausii QL－1ΔspoIIE與 B.clausii QL－1相比生長趨勢基本相同，在穩定期時菌體量稍高，生長繁殖明顯加快，在特定時間段生物量(菌體干重)均高于出發菌株，20 h時B.clausii QL－1ΔspoIIE及B.clausii QL－1菌株最大生物量達到最大，分別為3.00、2.50 mg·mL－1，spoIIE 基因缺失菌株 B.clausii QL－1ΔspoIIE較出發菌株生物量提高了20%。

圖3 B.clausii QL－1及B.clausii QL－1ΔspoIIE菌株芽孢萌發結果Fig.3 Results of spore germination results of B.clausii QL－1 and B.clausii QL－1ΔspoIIE

圖4 B.clausii QL－1及 B.clausii QL－1ΔspoIIE菌體LB培養基生長曲線測定結果Fig.4 Results of determination of growth curve in LB medium of B.clausii QL－1 and B.clausii QL－1ΔspoIIE

圖5 B.clausii QL－1及 B.clausii QL－1ΔspoIIE菌體細胞干重測定結果Fig.5 Results of determination of bacterial cells dry weight in B.clausii QL－1 and B.clausii QL－1ΔspoIIE

2.4 spoIIE基因對淀粉酶的影響

可溶性淀粉平板初篩，結果見圖6，重組菌株B.clausii QL－1ΔspoIIE 較出發菌株B.clausii QL－1淀粉水解透明圈明顯增大，B.clausii QL－1ΔspoIIE菌株淀粉水解透明圈與菌落直徑比為2.96，B.clausii QL－1透明圈與菌落直徑比為1.42，可以得知重組菌株較出發菌株水解淀粉能力明顯增強。進一步對重組菌株及出發菌株于發酵培養基發酵培養并測定淀粉酶酶活，結果見圖7，B.clausii QL－1ΔspoIIE 及B.clausii QL－1菌株發酵至84 h淀粉酶酶活分別為 4.8×105、0.86×105U·g－1，B.clausii QL － 1ΔspoIIE 淀粉酶酶活是B.clausii QL－1的5.58倍，淀粉酶酶活明顯增強。

圖6 出發菌株及重組菌株透明圈大小比對圖Fig.6 Comparison of the size of the transparent circle produced by B.clausii QL－1 and B.clausii QL－1ΔspoIIE

圖7 B.clausii QL－1 和 B.clausii QL－1ΔspoIIE淀粉酶酶活測定結果Fig.7 Results of determination of amylase activity in B.clausii QL－1 and B.clausii QL－1ΔspoIIE

2.5 補料與未補料發酵對比

對B.clausii QL－1ΔspoIIE進行初步補料發酵，補料結果如圖8所示，菌體的生長在20～30 h內趨于平穩，30 h開始補料，35 h后生物量逐漸升高，對數生長期延長、生物量增大，菌體干重測定如圖9所示。由圖8和圖9可知，進行補料的B.clausii QL－1ΔspoIIE菌株OD600最大值達到 13.962，生物量(菌體干重)為7.20 mg·mL－1;未補料最大 OD600為9.546，生物量(菌體干重)最大為 5.40 mg·mL－1，B.clausii QL－1ΔspoIIE 菌株生物量補料較未補料提高33.30%，通過補料培養至84 h。如圖10所示，B.clausii QL－1ΔspoIIE菌株α－淀粉酶酶活達到最大為690 U·mL－1，而未補料淀粉酶酶活最大為 492 U·mL－1，B.clausii QL－1ΔspoIIE 菌株補料后生物量及α－淀粉酶酶活均得到較大提高，通過補料使B.clausii QL－1ΔspoIIE菌株實現了初步高密度連續發酵。

圖8 B.clausii QL－1ΔspoIIE補料和未補料生長曲線測定結果Fig.8 Results of determination of B.clausii QL－1ΔspoIIE added nutrition and no added nutrition growth curve

圖9 B.clausii QL－1ΔspoIIE補料和未補料菌體干重測定結果Fig.9 Results of determination of B.clausii QL－1ΔspoIIE added nutrition and no added nutrition bacterial cells dry weight

圖10 B.clausii QL－1ΔspoIIE補料和未補料淀粉酶酶活測定結果Fig.10 Results of determination of B.clausii QL－1ΔspoIIE added nutrition and no added nutrition amylase activity

3 結論

利用重疊PCR技術，通過電轉化將重疊片段spoIIE－Cmr轉化到 B.clausii QL－1，成功實現了克勞氏芽孢桿菌spoIIE基因的敲除。通過對構建的B.clausii QL－1ΔspoIIE工程菌株的初步研究，發現 B.clausii QL－1ΔspoIIE較出發菌株芽孢生成率極大降低，生物量提高20%，通過補料分批發酵，B.clausii QL－1ΔspoIIE菌株生物量又提高了13.30%。表明spoIIE基因不僅是克勞氏芽孢桿菌芽孢形成關鍵基因，而且對菌株生長及高密度連續發酵的實現作出重要的貢獻。通過對B.clausii QL－1ΔspoIIE菌株的進一步研究發現該菌淀粉酶酶活是出發菌株的5.58倍，補料后淀粉酶活達到690 U·mL－1，由此可知spoIIE基因是克勞氏芽孢桿菌淀粉酶生成的重要相關基因，該發現對高產淀粉酶芽孢桿菌類微生物的構建具有一定的指導意義。