磁感應電場提取松茸多糖工藝優化

孟 嫚，張延杰，楊 哪 ，徐學明

(1.咀香園健康食品(中山)有限公司，廣東中山528437;2.江南大學食品學院，江蘇無錫214122;3.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

多糖類的化合物廣泛存在于各類植物原料中，它們通常具有降血壓，抗老化及抑制腫瘤細胞生長的特殊功效，因而能夠作為一種功能性食品原料并廣泛的運用在飲料、乳制品和保健產品［1］。松茸是一種珍貴的可食用類真菌，在我國主要分布在東北及西南地區。松茸香氣宜人，菌肉肥厚，味道鮮美深受人們的喜愛［2］。同時，松茸多糖來源于松茸(Tricholoma matsutak)的子實體中，含量較大且氣味芬芳，能起到提高免疫力和降低膽固醇的作用，特別是其中的甘露聚糖能有效抑制腹水癌并有益腸道健康，因而具有較高的藥用價值及開發前景［3］。

劉剛采用響應面技術對松茸多糖的提取工藝進行了優化，并對水提法的關鍵參數進行了影響分析，發現在95℃下經歷3.5 h，最大可獲得12%的多糖提取率［4］。同時，孫培龍利用微波輔助技術對松茸多糖進行了提取，發現于120℃且微波處理10 min，可獲得9%的多糖提取率［5］。另一些酶法輔助提取松茸多糖的研究也有廣泛報道［6－7］。然而，這些技術都是采用的傳統水浴提取法(conventional method)［8］。為了實現多糖類天然產物的高效率提取，近年來對一些非傳統方法(non－conventional method)也有大量研究報道，比如超聲波輔助提?。?］，歐姆加熱提?。?0］，微波輔助提取［11］，超臨界二氧化碳提取［12］，高壓脈沖電場提?。?3］。磁感應的電場是利用交變磁場產生交變電場的原理，在沒有任何金屬電極參與的情況下，對閉合回路中的樣品生產電效應(感應電場和感應電流)，以便在較短時間內，完成對植物類原料中天然產物的提取。Jin等［14］首先利用感應原理和試驗性的變壓器結構對鹽漬黃瓜漿體中的感應電壓和終端電壓進行了測量，發現液態樣品中的離子濃度越高則終端電壓就越強。Yang等［15］采用多級串聯的磁回路作為激勵源對流體中的桑葉顆粒進行處理并對多糖得率的變化進行了研究，發現勵磁強度和體系電導率的提高有利于提取加工，而多糖得率則和頻率呈現負相關關系。由于該電場的激勵源來源于磁場而非金屬極板，因此可避免傳統電場技術在高溫提取時，造成的電化學反應，極板腐蝕及金屬離子污染［16］。

本研究采用管式反應器并結合磁感應電場來輔助提取松茸中的多糖物質，通過單因素試驗分析了松茸多糖在提取過程中，水提溫度、時間、固液比、激勵電壓、頻率對其得率的影響，同時對比水提法提取時產物的理化特性差異，期待為松茸多糖的高效利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

濃硫酸，95%乙醇，丙酮，乙醚，氯仿，磷酸氫二鈉(均為分析純)，鄰苯三酚，Tris試劑，1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl，DPPH)(以上試劑均為化學純) 國藥集團化學試劑有限公司;新鮮松茸 市購。

UV－1900雙波長紫外－可見分光光度計 普析通用儀器有限責任公司;HH－4恒溫水浴鍋 常州丹瑞實驗儀器設備有限公司;ZT－150型中藥材粉碎機 永康市展帆工貿有限公司;DGG－9070A軍工小烘箱 上海森信實驗儀器有限公司;RE52CS旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;RW20機械式攪拌機 德國 IKA公司;PL602 12106450－CN電子天平 廣州儀科實驗室技術有限公司;RJ－LDL－50A低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠;Free Zone 6L凍干機 美國Labconco公司;MTC－400磁感應電場反應裝備 岐昱實業(上海)有限公司;FE30K電導率計 瑞士梅特勒－托利多集團;FE28臺式酸度計 瑞士梅特勒－托利多集團;65120B采用精密阻抗分析儀 英國Wayne Kerr電子有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 每次稱取約1000 g的松茸，并對其子實體進行清洗和除雜，將清洗完的子實體表面水分用紙巾吸干，切片(厚度2 mm)，放進60℃烘箱干燥至恒重，粉碎，過120目篩，得到松茸子實體粉末。

1.2.2 多糖的提取

1.2.2.1 熱水提取 準確稱取50 g子實體干粉末，按不同固液比加入蒸餾水，于不同溫度水浴進行浸提，期間緩慢攪拌，于一定時間后在4000 r/min下離心20 min，用旋轉蒸發儀于50℃時將上清液濃縮到原液的20%，緩慢地加入3倍體積的95%乙醇，再于4℃低溫放置 24 h，待棕色絮狀粗多糖析出，于4500 r/min離心20 min，收集沉淀物并采用丙酮+乙醚(1∶3)抽濾兩次，除去脂肪，30℃ 烘干;再將上述得到的固體樣品配制成約1%的溶液，加入其25%體積的Sevage試劑［氯仿∶正丁醇=5∶1(V/V)］，振蕩20 min，4000 r/min離心10 min，分液漏斗分離取含有多糖的上清液，重復三次。最終，將得到的上清液放于－40℃的冰箱凍塊后再放進凍干機中進行干燥得到多糖粉末［4］。

1.2.2.2 磁感應電場輔助提取 準確稱取50 g子實體干粉末，按不同固液比加入蒸餾水，于一定溫度下以200 mL/min的流量泵入感應電場反應裝備，原理如圖1所示，磁路為取向硅鋼27QG120，單相O型結構，鐵芯柱直徑220 mm，鐵芯高度685 mm，鐵芯寬度580 mm，鐵芯窗高335 mm，鐵芯窗寬160 mm，樣品管道內徑4 mm，功率10 k W)，期間施加一定頻率的勵磁電壓，處理一定時間后在4000 r/min下離心20 min，后續操作同1.2.2.1。

圖1 磁感應電場輔助提取原理Fig.1 The auxiliary extraction principle by magneto－induced electric field

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 熱水提取多糖 分別考察:不同溫度(70、80、90、100 ℃)于固液比為1∶30 g/mL 和時間8 min;不同時間(4、8、12、16、20 min)于溫度70 ℃和固液比1∶30 g/mL，以及不同固液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL)于溫度 70℃和時間 8 min時的多糖得率。

1.2.3.2 磁感應電場提取多糖 分別考察:不同激勵電壓(700、800、900、1000、1100 V)于頻率 400 Hz，溫度70℃，固液比1∶30 g/mL和時間8 min;不同頻率(300、400、500、600、700 Hz)于激勵電壓 800 V，溫度70℃，固液比1∶30 g/mL和時間8 min;不同溫度(70、80、90、100 ℃)于激勵電壓 800 V，頻率 400 Hz，固液比為1∶30 g/mL和時間8 min;不同時間(4、8、12、16、20 min)于激勵電壓800 V，頻率 400 Hz，溫度70℃和固液比1∶30 g/mL，以及不同固液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL)于激勵電壓 800 V，頻率400 Hz，溫度70℃和時間8 min時的多糖得率，從而分析磁感應電場工藝參數對多糖得率的影響規律。

1.2.4 磁感應電場提取多糖的工藝優化 通過單因素實驗，將得出的各個較優參數采用正交試驗法對其進行優化，建立激勵電壓、電場頻率、溫度、固液比、提取時間的5因素4水平正交試驗，方案采用L16(45)的設計形式，具體參數選擇見表1所示。

表1 L16(45)正交試驗設計方案及因素水平表Table 1 Factors and levels of L16(45)orthogonal experimental design

1.2.5 多糖含量測定

1.2.5.1 標準曲線繪制 采用苯酚－硫酸比色法，在490 nm處測定吸光度。以葡萄糖濃度C(0、10、20、30、40、50、60 μg·mL－1)為橫坐標，吸光度 A 為縱坐標，繪制吸光度－葡萄糖濃度的關系曲線，步驟參考陳煉紅的方法［17］，得到的標準曲線方程為 A=0.5349C+0.0271，相關系數R2=0.9941。

1.2.5.2 松茸提取液中多糖含量的測定 將提取后經干燥過的多糖用體積分數80%乙醇溶液定容于500 mL容量瓶內，吸取1.0 mL以超純水補至2.0 mL。分別加入質量分數6%的苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，搖勻，室溫放置20 min后于紫外－可見分光光度計490 nm波長處測吸光度。將測定出的吸光度代入葡萄糖標準曲線中便可得到多糖提取液中多糖的含量。按下面公式計算出松茸多糖的得率:

式中:Y為松茸多糖得率，%;M1為松茸粉末樣品，mg;M2為依據回歸方程計算出的粗多糖質量濃度，mg/mL。

1.2.6 介質理化特性測定 料液p H和電導率分別采用酸度計和電導率計進行測定。

1.2.7 流體阻抗測定 采用精密阻抗分析儀對松茸懸浮液流體阻抗進行測量，將其中的流體阻抗探頭進口和出口管路連接入系統中，保證其探頭的極板測試距離與系統管道內徑一致，測試前分別進行開路(空氣)、短路(銅塊)和高頻(100 Ω 電阻，10、100 pF電容于50 Hz～10 MHz)校正，然后測試樣品流體的阻抗［18］。

1.3 數據處理方法

采用SPSS 16.0軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 激勵電壓對松茸多糖得率的影響

圖2為不同激勵電壓對松茸多糖得率的影響，激勵電壓施加于鐵芯時，料液體系作為次級回路(或閉合電路)即出現感應電壓，作為水相體系的料液負載中同時出現磁感應的電流?？梢钥闯?，當激勵電壓低于1000 V時，多糖得率隨激勵電壓的提升而顯著提高(p＜0.05)，1000 V下的多糖得率相對于水提組(0 V)則提高了4.9倍。松茸粉水相懸浮液(1∶30 g/mL)的pH為6.3，同時其電導率為3.4 S/m(表2所示)，內部含有大量的自由離子和帶電粒子，料液體系具有一定的導電能力。所有電場加工技術(歐姆加熱和高壓脈沖電場)，需要反應體系具備一定的傳導性(0.1～20 S/m)［19］。電場效應能夠有效的通過交變磁場的耦合作用于反應介質。在交變電場影響下，料液的電導率越高則系統的能量效率越大［20］。這是因為介質中的帶電溶質越多則電導率越大，其次級回路的料液阻抗就降低，根據焦耳定律，樣品的消耗功率就提高。同時，在處理過程中施加的電壓會在傳導性的料液中引發電流，造成帶電溶質的大規模定向遷徙并隨即產生熱效應，使溶質的傳質效率提高［21］，進一步的促進松茸多糖的溶出［22］。當系統中的磁場磁通密度小于磁飽和水平時，隨著激勵電壓的提升，松茸多糖得率也隨之增加，但增幅則逐漸減少。比如，激勵電壓1000 V相對于900 V，900 V相對于800 V，800 V相對于700 V的處理樣品則多糖得率分別增加了25.3%、23.0%和22.6%。但當激勵電壓超過1000 V時，系統中的磁場磁通密度超過磁飽和水平，造成磁場的大幅損耗，進而引起系統的輸出功率減弱，所以多糖得率反而降低。因此，單因素提取工藝中的最適激勵電壓為1000 V。

表2 不同固液比下的料液pH和電導率Table 2 The pH－value and conductivity of the medium with various solid－liquid ratio

圖2 激勵電壓對松茸多糖得率的影響Fig.2 The effect of excitation voltage on the yield of Tricholoma matsutake polysaccharide

2.2 頻率對松茸多糖得率的影響

從圖3得知，當激勵電壓頻率提高則松茸多糖的得率出現降低的趨勢。相對于700 Hz電場頻率，400、500、600 Hz時的多糖得率分別提高了55.8%、38.6%和24.8%。根據磁感應原理，隨著頻率的提高，料液中的感應電壓保持不變，但系統中的磁場密度下降，初級線圈的阻抗則會增加，最終造成系統的總磁通量和輸出功率降低，導致多糖的提取效率降低。進一步，液態樣品中的帶電溶質在交變電場力作用下會進行定向性的遷徙即形成感應電流，使得樣品顆粒經受低強度和低頻的“摩擦”作用。系統將勵磁后的磁能轉換為電能后施加于料液體系并轉換為焦耳熱能(inductive heating)［23］。同時，料液中的熱損耗也即歐姆熱，有利于多糖產物從樣品組織的細胞及其間隙中的溶出。不同的導磁材料具有最適的工作頻率，即在該工作頻率時的系統磁損耗最小，能量輸入水平最高，故當前系統的最適頻率為400 Hz。

圖3 頻率對松茸多糖得率的影響Fig.3 The effect of frequency on the yield of Tricholoma matsutake polysaccharide

2.3 溫度和時間對松茸多糖得率的影響

從圖4a可知，隨著提取溫度的增高其松茸多糖得率也呈現上升的趨勢。磁感應的電場加工同歐姆加熱OH(ohmic heating)和中強電場MEF(moderate electric field)技術一樣，溫度和電場強度是提升反應體系傳質效率的主要因素，原理上都是增加了對介質的能量輸入進而提高了傳質效率［24］。例如，當傳導性的溶液插入鈍性的金屬電極后，料液體系的溫度迅速提升，因而其帶電溶質的傳質效率也會相應提高。該研究中不同提取溫度70、80、90、100℃的樣品相對于水提組(0 V)，施加激勵電壓后多糖的得率分別提高了287.4%、232.1%、129.3%和100.1%。因此，從多糖得率的提升效率和能耗綜合考慮，最適溫度選為80℃。從圖4b可知，隨著處理時間的延長松茸多糖的得率(電場組和水提組)也顯著提高(p＜0.05)，但電場組樣品在16 min時的多糖得率趨于穩定即10.33%，同時電場組的輸出功率也繼續增加。因此，電場組的處理時間在16 min較為適宜。

圖4 溫度和處理時間對松茸多糖得率的影響Fig.4 The effect of temperature and processing time on the yield of Tricholoma matsutake polysaccharide注:a:溫度;b:時間。

2.4 固液比和流體阻抗對松茸多糖得率的影響

從圖5a可知，不同固液比下經磁感應電場處理的樣品相對于水提組(0 V)，其多糖的得率分別提高了 171.8%(1∶20 g/mL)，313.4%(1∶25 g/mL)，

257.1 %(1∶30 g/mL)和 187.8%(1∶35 g/mL)。同時，隨著固液比的提高其松茸多糖得率出現先升高而后下降的趨勢，這可能跟樣品的流體阻抗有關。流體阻抗水平反映出連續流的樣品溶液對特定頻率交變電流的阻礙能力，其值越高則料液的傳導性就越差，樣品中的感應電流就越小，系統能量輸入水平就越低。從圖5b可知，隨著反應體系固液比的增加，其松茸懸浮液流體阻抗先降低后升高，而樣品的電導率則先升高后減少(表2所示)，松茸多糖得率呈現先增加后降低的趨勢(圖5a)。當感應電壓不變時，進一步根據歐姆定律可知，其介質的阻抗值越低則流體的傳導性就會提高［25］，系統能量效率提升進而導致多糖得率增加，反之亦然［25］。因此，由單因素試驗可知電場組的最適固液比為1∶25 g/mL。

圖5 固液比對松茸多糖得率和流體阻抗的影響Fig.5 The effect of solid－liquid ratio on the yield of Tricholoma matsutake polysaccharide and its fluid impedance注:a:多糖得率;b:流體阻抗。

2.5 最優工藝及參數影響分析

根據上述單因素實驗所得到的因素水平并按表3的實驗方案進行提取工藝優化，稱取16份松茸粉并根據上述編號條件進行其多糖的磁感應電場提取，隨后測量各組樣品溶液中的多糖得率，結果如下。

由表3分析可知，各工藝參數對松茸多糖得率的影響主次為:電場頻率(B)＞激勵電壓(A)＞時間(E)＞溫度(C)＞固液比(D)。同時，該多糖得率的最優工藝參數組合為 A3B3C4D3E3，即激勵電壓為1000 V、頻率 500 Hz、溫度 100 ℃、固液比為1∶30 g/mL、時間16 min。在此工藝條件下，進行3次重復提取試驗，則多糖得率達到了14.32% ±1.2%，而在相同固液比(1∶30 g/mL)、提取溫度(100℃)和提取時間(16 min)下水提組(0 V)的多糖得率為8.74%±1.3%，故上述優化組相對于水提組的多糖得率提高了47.99%。

表3 正交試驗設計及結果Table 3 Experimental designs and results

3 結論

采用大功率的磁感應電場裝備對松茸子實體中的多糖進行了有效提取，結果表明:多糖得率與系統的激勵電壓和溫度呈現正向相關，并隨電壓頻率的增加而減少，同時存在著最佳的提取系統固液比。根據5因素4水平的正交試驗結果，得出不同磁感應電場輔助提取參數對松茸多糖得率的影響主次為:電場頻率＞激勵電壓＞時間＞溫度＞固液比。磁感應電場輔助松茸多糖的最優工藝參數為激勵電壓1000 V、電場頻率 500 Hz、溫度 100℃，固液比1∶30 g/mL，時間16 min，松茸多糖得率為14.32% ±1.2%，比熱水提取法提高了47.99%。該技術為植物類原料中的高價值產物的有效提取提供了一種參考方法。