微生物法快速測定食品中葉酸含量范圍

田 浩，王志偉，顧文佳，曲勤鳳

(上海市質量監督檢驗技術研究院，上海200233)

葉酸，是一種重要的水溶性B族維生素，作為一碳單位的重要前體物質，參與到人體內許多重要的細胞通路循環中，包括DNA、RNA和蛋白質的甲基化和DNA合成、修復等［1］。居民膳食中的新鮮水果、蔬菜和肉類等食品富含天然葉酸，然而天然葉酸并不穩定，容易在食物的儲存、烹飪過程中損失［2］。人工合成的葉酸性質穩定，被廣泛用作營養強化劑［3］。學界普遍認為，葉酸強化食品可以降低神經管缺陷風險［4］，并推薦孕產婦群體補充葉酸［5－6］。國家強制標準規定葉酸是嬰幼兒配方食品、特殊醫學用途配方食品等食品的必需成分，消費者也越來越重視食品中維生素的含量。在此背景下，食品企業相繼加大了強化葉酸食品的研發力度。

國標《GB 5009.211－2014食品安全國家標準食品中葉酸的測定》是現行有效的葉酸檢測標準，其主要原理是利用鼠李糖乳桿菌Lactobacillus casei spp.Rhamnosus(ATCC 7469)生長過程中對葉酸需求的特異性，在一定控制條件下，將鼠李糖乳桿菌液接種至預先加入待測樣品提取液的培養液中，根據葉酸含量與透光率(或吸光度值)的標準曲線，計算出待測樣品中葉酸的含量。該國標方法規定了三大類食品的測定方法，包括果蔬類，蛋白質、淀粉含量高的試樣和營養強化劑和強化食品［7］。此外，針對不同含量葉酸食品的測定，國內外學者也提出了許多相應的方法，主要有化學發光測定法［8］、高效液相色譜法［9－13］、分光光度法［14－16］、ELISA 法［17－18］、改良微生物法［19－23］等。這些方法各有優勢，對葉酸含量較高、較低樣品的測定均有探討，所用方法的檢測時長不一，檢測靈敏度也有所差別［24］。國標所使用的微生物法通常耗時3～4 d，且步驟復雜，對檢測人員素質和所用儀器狀態要求很高。當需要測定葉酸含量范圍未知的樣品時，檢測人員很難確定樣品稱樣量。因此，對國標方法進行改進和優化是十分必要的。

本文在國標GB 5009.211－2014方法的基礎上進行了改進，利用鼠李糖乳桿菌生長過程中對葉酸需求的特異性，使用一次性離心管替代玻璃試管作為培養容器，同時將整個培養體系縮小至1 mL，培養時間縮短為8～12 h，在對得到的吸光度數據簡單換算后，得到待測樣品葉酸含量范圍，并進行方法學考察，與國標法進行對比，判斷其是否具有可行性，為最終使用國標方法準確測定提供樣品葉酸含量范圍的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葉酸標準品 Supelco，純度≥97%;嬰幼兒配方乳粉 市售;復合維生素預混料、孕婦餅干 市售;葉酸含量不明的植物提取物1(液態)、植物提取物2(固態) 科研樣品，云南農業大學;鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus casei)ATCC 7469 北京陸橋;葉酸測定用培養基 (碧迪);甲鹽溶液、乙鹽溶液、瓊脂培養基 按國標要求配制;改良MARS培養基 北京陸橋;所有試劑 均為分析純。

SX－700高壓滅菌鍋 TOMY;SHP－250恒溫培養箱 SHELLAB;infinite M200全波長多功能微孔板分析系統 TECAN;Vortex Genie 2渦旋振蕩器 美國 Scientific Industrise，Inc。

1.2 實驗方法

1.2.1 工作菌液培養物的制備 將保存的鼠李糖乳桿菌轉接至瓊脂培養基上，在(37±1)℃恒溫培養箱中培養20～24 h，再傳種1代。挑取單菌落到葉酸測定用培養基，(36±1)℃在培養箱中培養24 h。隨后，移取1 mL上述帶菌培養液，加入2 mL無菌離心管中，再加入1 mL無菌甘油，放入－20℃冰箱中儲存［25］。每批儲存菌液可保存3個月。使用時，吸取0.5 mL儲存菌液接種到10 mL葉酸測定用培養基，(36±1)℃活化培養6 h后即可作為工作菌液培養物立即使用。若不能立即使用，工作菌液培養物在4℃冰箱中可保存不超過1周。

傳代方法:沾取一環工作菌液培養物劃線接種于改良MRS平板上，(36±1)℃厭氧培養(72±2)h，之后保存于2～5℃低溫冰箱。測定前，用接種環小心挑取少量單菌落，接種于10 mL葉酸測定用培養基中，置于(36±1)℃培養箱中培養24 h。取出后放入4℃冰箱中儲存，1周內用完。同時記錄菌種代數，傳代一般不超過5代。

1.2.2 樣品測定液的制備 樣品測定液制備參照國標要求進行。根據樣品分類，固態和半固態樣品分別進行粉碎、研磨、過篩，液態樣品用前搖勻備用;

本文采用粗提手段快速確定樣品中葉酸的含量范圍。稱取1 g樣品到50 mL離心管中，用氫氧化鈉乙醇溶液定容至40 mL，于121℃(0.10～0.12 MPa)高壓滅菌15 min，取出后快速冷卻至室溫。在超凈工作臺內使用無菌過濾器過濾，得到樣品工作液原液。使用無菌水對工作液原液進行10倍梯度稀釋，得到一系列工作液稀釋液。最高稀釋度根據對樣品含量的估計，自行選擇。一般地，嬰幼兒配方奶粉最高稀釋度不宜超過300倍，維生素預混料稀釋度范圍在103～105倍，含量較低的天然食品稀釋度不宜超過100倍。

1.2.3 標準曲線溶液的制備 參照國標要求，在超凈工作臺內使用無菌過濾器過濾標準工作溶液，相當于標準系列管中的葉酸含量分別為0.00、0.01、0.04、0.06、0.08、0.10 ng，備用。每隔一周應重復此步驟，將標準曲線數據與以前的數據對比，若同一標準點的吸光度值出現顯著變化，應重新評估本法的檢出限范圍和線性范圍。

1.2.4 接種和培養 在無菌操作條件下，向每個已滅菌的離心管內加入1.2.1制備的工作菌液培養物500μL，隨后加入1.2.2制備的樣品測定液稀釋液作為測定組;在相同的條件下，加入1.2.3制備的標準工作液作為標準曲線組。兩組同時在每管中加入400μL無菌蒸餾水，充分混勻。一個樣品液或標準工作液重復3次。培養物總體積為1 mL。設置陰性對照，將樣品測定液稀釋液替換為不含葉酸的生物素溶液;設置空白對照，將樣品測定液稀釋液替換為無菌蒸餾水。將培養物置于(37±1)℃恒溫培養箱中培養8～12 h。

1.2.5 葉酸含量的測定 將1.2.4中培養過的培養物用漩渦振蕩儀混勻。按照標準工作溶液、待測試樣、陰性對照、空白對照的順序，向酶標板孔加入上述300μL培養物，同一管培養物做3個平行孔。在620 nm波長條件下讀取各培養物的吸光度值。其中陰性對照、空白對照應無細菌生長，吸光度值應在0.1以下，否則可能混入不明來源葉酸或者接種菌液中含有殘余葉酸;標準曲線、待測試樣最高吸光度不宜超過1.0，否則應減少菌液接種量。

1.2.6 標準曲線的繪制 以標準工作溶液的葉酸含量為橫坐標X，每個標準點的吸光度值為縱坐標Y，繪制標準曲線。標準曲線決定系數R2應大于0.98。得到的標準曲線方程為Y=4.590X+0.07360，R2=0.9904。

1.2.7 樣品葉酸含量的計算 從標準曲線查得樣品培養物中葉酸的相應含量(cx)，且各EP管之間查得的葉酸含量的偏差小于15%，則可按照式(1)進行結果計算;否則需重新取樣測定。

式中，X:待測樣品中葉酸含量，單位為微克每百克(μg/100 g);cx:從標準曲線上查得的菌懸液培養物離心管中葉酸含量，單位為納克(ng);k1:由1.2.2制備的樣品測定液工作液原液對應的1 g樣品的定容體積，單位為mL;k2:由1.2.2制備的樣品測定液工作液原液的稀釋倍數。

1.2.8 方法檢出限范圍的確定 本方法檢出限定義為:加菌培養物培養12 h后，菌懸液吸光度高于空白對照吸光度0.1的樣品中葉酸的最低含量。該方法檢出限與每次測試時的菌種狀態、加菌量密切相關。因此，作為一種快速估算方法，已知樣品稀釋倍數的情況下，樣品含量的下限范圍可以根據式(2)檢出限范圍快速估算，且估算含量的準確度與方法檢出限的范圍大小密切相關。在本實驗室中進行的重復試驗證明，該方法檢出限范圍較小，精密度較高。

式中，X:待測樣品中葉酸含量，單位為微克每百克(μg/100 g);cn:方法檢出限，單位為微克每百克(μg/100 g);kmax:葉酸濃度高于檢出限的最大稀釋度。

1.2.9 方法線性范圍的確定 本方法線性范圍的定義為:加菌培養物在過夜(12 h以上)培養后，菌懸液吸光度與培養物中葉酸含量成線性相關的葉酸含量范圍。同樣地，該方法線性范圍與測試時菌種狀態，加菌量密切相關。同理，作為一種含量的快速估算方法，已知樣品稀釋倍數的情況下，樣品含量的上限范圍可以根據式(3)線性范圍快速估算，且估算含量的準確度與方法區間的范圍大小密切相關。

式中，X:待測樣品中葉酸含量，單位為微克每百克(μg/100 g);k1:由1.2.2制備的樣品測定液工作液原液對應的1 g樣品的定容體積，單位為mL;kmin:葉酸濃度低于線性范圍上限的最低稀釋度。

1.2.10 方法回收率范圍的確定 本方法回收率范圍的定義為:樣品待測液加菌培養物在過夜(12 h以上)培養后，選取多個時間點，取出該培養物分別測定吸光度值。根據(式1)計算出待測液葉酸含量并換算為葉酸添加量，與實際葉酸添加量的百分比。

2 結果與分析

2.1 方法的檢出限范圍

本實驗室按1.2.1制備測試菌液，并選擇一系列較低濃度的標準品進行了10次測試，每次測試記錄下吸光度高于空白對照吸光度0.01以上的標準品濃度。將該濃度換算成樣品含量，由低到高排列，得出在本實驗室條件下，樣品量為1 g，用氫氧化鈉乙醇溶液定容至40 mL時，利用現制測試菌液進行測定，方法檢出限范圍為0.4～0.8μg/100 g。

2.2 方法的線性區間范圍

在過夜培養(12 h以上)后，直到培養的第72 h，同一時間取出培養物讀取吸光度值，同一批測試的線性區間不會隨著時間的推移發生明顯變化，但是菌懸液吸光度隨時間增大。

本實驗室按1.2.1制備測試菌液，并選擇一系列濃度標準品進行了10次測試，每次測試記錄下本方法線性范圍，得出在本實驗室條件下，利用現制測試菌液進行測定，方法線性范圍為0.01～0.08 ng。

2.3 方法的回收率范圍

經過實驗室多次試驗，該方法的回收率范圍與測試時菌種狀態，加菌量無顯著關系。同一時間取出培養物讀取吸光度值，同一批測試的回收率不會隨著時間的推移發生明顯變化，但是菌懸液吸光度隨時間增大。本實驗室按1.2.1制備測試菌液，分別添加10、40、80μg葉酸標準品，按式(1)推算待測液含量，分別進行6次測定，加標回收率測定結果如表1所示，得出本方法回收率范圍為:82.1%～108.0%。

表1 加標回收率測定結果Table 1 Results of recovery test(n=6)

2.4 快速確定樣品的含量范圍

取市售嬰幼兒配方乳粉、復合維生素預混料、葉酸含量不明的植物提取物樣品，按1.2.2制備樣品溶液，記錄稀釋倍數k1。隨后將樣品測定液10倍梯度稀釋，作為待測液加入含菌培養液中，培養過夜(12 h以上)。隨后取出，測定菌懸液吸光值。將稀釋倍數的lg值為橫坐標，菌懸液吸光度值為縱坐標，繪制散點圖，結果如圖2所示。

圖2 3類典型樣品測定結果Fig.2 Results of three typical samples注:A:復合維生素預混料測定結果。菌懸液吸光度均大于1.0，數據點無顯著線性關系;B:植物提取物1樣品測定結果。菌懸液吸光度均小于0.1，數據點無顯著線性關系;C:嬰幼兒配方乳粉樣品測定結果。至少有一菌懸液吸光度位于0.1～1.0之間，且其中相鄰兩點或三點的趨勢線與剩余各點的趨勢線斜率有顯著區別。

圖A表示該樣品經過稀釋，最高稀釋度待測液內葉酸含量大于0.08 ng，記錄最高稀釋倍數k2，因此該樣品葉酸含量大于0.08×k1×k2;圖B表示該樣品經過稀釋，最低稀釋度待測液內葉酸含量小于0.01 ng，因此該樣品葉酸含量小于0.01×k1;圖C表示該樣品經過稀釋，有100倍稀釋度葉酸含量位于0.01～0.08 ng之間。因此該樣品葉酸含量范圍為0.01×k1×100～0.08×k1×100。

樣品葉酸含量范圍可以通過兩個方法驗證得到。對于葉酸含量相對較低的樣品，多次梯度稀釋得到大于方法檢出限葉酸含量的最大稀釋度kmax，由式(2)得到葉酸含量下限;同理，葉酸含量相對較高的樣品，多次梯度稀釋得到小于方法線性范圍上限葉酸含量的最小稀釋度kmin，由式(3)得到葉酸含量上限。

2.5 估算樣品的含量

若需估算樣品含量，可以在確定樣品含量范圍后，將該樣品稀釋到kmin倍后，依次進行4次2倍梯度稀釋，作為待測液加入含菌培養液中，另做兩管標準品含菌培養液，分別添加0.01、0.08 ng葉酸標準品，同時培養過夜(12 h以上)。隨后取出，測定菌懸液吸光度值。以葉酸含量為橫坐標，菌懸液吸光度值為縱坐標，繪制兩點連線。從兩點連線確立的直線方程換算出待測液葉酸含量，再根據式(1)估算出樣品含量。

本實驗室選取了4類檢測中遇到的葉酸含量未知的典型樣品，分別進行6次測定，將本方法與國標檢測結果進行對比，并分別取平均值和方差做t檢驗和F檢驗，結果見表2。

表2 國標檢測方法與本方法的比較(n=6)Table 2 Comparison of GB 5009.211－2014 method and microbiological method(n=6)

由此可見，除嬰幼兒配方奶粉外，本方法與國標法對其他樣品的測定平均值沒有顯著差異(p＞0.05)，但兩種方法平均值差值與算數平均值之比均小于11%。在較葉酸含量較高的復雜樣品(植物提取物2)的測定中，本方法相比國標法出現了較大的變異系數(p＜0.0001)。但總體來說，本方法可以較好地預估樣品葉酸含量范圍，估算葉酸含量也與國標測定方法接近。盡管對部分樣品的測定不如國標方法穩定，但不影響它作為快速檢測方法提前預估樣品葉酸含量范圍的作用。為了更好地為國標法檢測服務，葉酸含量較高的樣品優先計算其含量上限，相對地，葉酸含量較低的樣品優先計算其含量下限。得到對應的上或下限后，根據國標法的要求，稱取相應的樣品量，因此可以保證樣品點均落在標準曲線范圍內，得到更加準確的結果。

3 結論

本文提出了一種快速測定食品中葉酸含量范圍的方法。該方法的檢出限范圍為0.4～0.8μg/100 g，線性范圍為0.01～0.08 ng，回收率范圍為82.1%～108.0%。相對于國標方法需要2～3 d時間測定，本方法只需1 d時間即可得到葉酸含量范圍，能在較短時間提供樣品葉酸含量范圍，且步驟簡潔，節約試劑材料。該方法可作為國標法測定葉酸含量的重要補充實驗，適用于葉酸含量存疑樣品的初步篩查或者數據確認。本文列舉了在實驗室內建立該檢測方法的關鍵步驟，包括菌懸液制備、方法檢出限確認、線性范圍摸索和數據處理。使用本方法和國標GB 5009.211－2014方法同時對4種典型樣品的葉酸含量進行測定，國標測定結果均落在本方法得到的葉酸含量范圍內。文中提出的方法建立步驟可為同行業者借鑒，希望可以提供自主研發微生物法葉酸測定試劑盒理論依據和實踐參考材料。