響應面優化硝普鈉法測定發酵液中的蛋氨酸含量

胡翠英，李良智，姚雪梅，王桃云，顧華杰

(蘇州科技大學化學生物與材料工程學院，江蘇蘇州215009)

蛋氨酸(Met)作為必需氨基酸之一，主要應用于飼料、醫藥、食品等行業。隨著Met需求量的逐年增長，其產量不斷提高，2016年全球Met產量達164.2萬噸，大約是2013年的2倍［1］。目前Met的獲取方法有生物酶拆分法［2］、發酵法、化學合成法等［3］，其中發酵法雖價廉、低污染，但由于代謝通路復雜而導致其產量較低，因此如何獲得Met高產菌株成為科研工作者的研究焦點。快速測定發酵液中Met含量對于篩選Met產生菌株有重要意義。

目前，發酵液中Met測定方法有:高效液相法(High－performance liquid chromatography，HPLC)［1，4］、氨基酸分析儀法(Aminoacid analyzer)［5］、薄層層析法(Thin layer chromatography，TLC)［6］、間接碘量法［7］、間 接 碘 量 法 結 合 凱 氏 定 氮 法［8－9］、 NTB(Nitrothiobenzoate) 顯色法［10］和硝普鈉(SNP) 法［11－12］等。高效液相色譜－質譜法與氨基酸分析儀法測定原理類似，通過改變流動相極性，將樣品中各種氨基酸分離開，同時采用柱前或柱后衍生法，在特定波長下測定氨基酸含量。這兩種方法的優點是準確、可靠，缺點是耗時、高價。碘量法和凱氏定氮法分別測定的是Met的甲硫基與氨基兩個基團的含量，二者配合使用，測定結果會較為可靠，但同時導致測定方法復雜化。NTB顯色法和SNP法均為光度測定法。NTB顯色法［10］優點是迅速、靈敏，但測定過程中需要用到有毒物質－DEPC(Diethy pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水。另一種分光光度法－SNP法，步驟簡單，耗時短，能迅速測定Met含量，但存在受其它氨基酸干擾的因素。20 世紀 40～80 年代 Mccarthy［13］、Smith［14］、Greenstein［15］、Ahmed［16］等已經對 SNP 法做了大量研究，目的是提高這種方法的靈敏度和可靠性等。目前許多文獻中［11－12］使用 SNP法測定 Met含量，但對反應中各試劑的添加原因、反應時間長短、干擾氨基酸影響程度等的報道較少。隨著時代發展，電子產品不斷更新換代，現代設備的檢測方法多樣化，靈敏度也越來越高。本文在原有測定方法的基礎上，結合最大吸收峰的測定，對SNP反應中各試劑的添加量、反應時間和吸收波長等進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 蠟樣芽孢桿菌(實驗室自篩);試劑:絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、賴氨酸(Lys)、半胱氨酸(Cys)、亮氨酸(Leu)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ile)、蛋氨酸(Met)、纈氨酸(Val)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr) 以上氨基酸均為L型，阿拉丁公司;SNP Sangon Biotech公司;種子培養基:牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，H2O 1 L，pH7.2，瓊脂20 g;發酵培養基:葡萄糖20 g(單獨滅菌)，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaNH4HPO43.5 g，K2HPO4·2H2O 11.9 g，(NH4)2SO41 g，檸檬酸·3H2O 2 g，NaSO410 g，H2O 1 L，pH6.5。

BT25S和BSA224S天平 德國賽多利斯公司(Sartorius);UV2450紫外可見分光光度計 日本島津公司(Shimadzu);ZQLY－180S恒溫搖床 上海知楚儀器有限公司;KQ－700DB超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司;A300全自動氨基酸分析儀 德國曼默博爾公司(MembraPure GmbH)。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵液中氨基酸種類分析 將菌株在種子培養基中活化過夜(30℃，200 r/min)，接種發酵液，接種量10%(v/v)，30 ℃，200 r/min，培養 72 h。發酵液離心(常溫10000 r/min離心10 min)，取上清液400μL，加入100μL 10%磺基水楊酸;2～8℃靜置60 min;14500 r/min常溫離心15 min;取上清液再次離心5 min;經0.22μm過濾器過濾后，在氨基酸分析儀上分析氨基酸組成。

1.2.2 初始硝普納法 發酵液1500 g離心15 min;5 mL上清液中加入1 mL 5 mol/L NaOH和0.1 mL 10%SNP溶液，搖勻試管，靜置10 min;加入2 mL 3%甘氨酸(Gly)水溶液，10 min內頻繁振蕩;將2 mL H3PO4逐滴加到混合物中，振蕩試管，反應5 min;在540 nm 處測吸光值［11－12］。

1.2.3 蛋氨酸合成過程中各氨基酸SNP反應吸收光譜 本次實驗選擇的其它氨基酸主要是Met代謝過程中涉及的氨基酸，包括 Met、Lys、Thr、Val、Ile、Cys、Ser、Tyr、His、Leu、Arg、Ala。各種氨基酸濃度為1.0 g/L，按1.2.2方法，觀察實驗過程中顏色變化，拍照，用紫外可見分光光度計掃描，波長范圍300～700 nm。

1.2.4 發酵液中各成分對Met含量測定的影響 將發酵培養基中 NaNH4HPO4(3.5 g/L)、MgSO4·7H2O(0.2 g/L)、檸檬酸(2 g/L)、(NH4)2SO4(1 g/L)、Na2SO4(10 g/L)、K2HPO4·2H2O(11.9 g/L)、葡萄糖(20 g/L)等分別按1.1中含量配成各自溶液，以蒸餾水為對照樣品，并分別滅菌。按1.2.2方法，用紫外可見分光光度計掃描吸收光譜，波長范圍300～900 nm。1.2.5 單因素實驗

1.2.5.1 試劑加入后反應時間對SNP法吸收光譜的影響 向上清液中加入1 mL 5 mol/L NaOH和0.1 mL 10%SNP 溶液，搖勻試管，靜置不同時間(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30 min)，分別測定吸收光譜;其中平行樣靜置30 min后，分別加入2 mL 3%Gly水溶液，不同時間(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 min)內頻繁振蕩，測定300～900 nm范圍內的吸收光譜;10 min后平行樣中，分別逐滴加入2 mL濃H3PO4，振蕩試管，反應不同時間(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40 min)，分別測定吸收光譜。

向含有1、2、3 g/L Met的無菌發酵液中分別加入1 mL 5 mol/L NaOH和0.1 mL 10%SNP溶液，分別靜置5、15、20、30、60 min，分別按照1.2.2 中的方法加入Gly與H3PO4，分別測定513 nm處的吸光值。

1.2.5.2 試劑加入量對Met測定的影響 基本按照1.2.2中的方法，稍作修改，加入NaOH與SNP后，靜置30 min，加入Gly后，振蕩反應10 min，加入H3PO4后，反應5 min。其它參數每次只改變一個因素。5 mol/L NaOH 加入 0、0.5、1.0、1.5、2 mL;10%SNP加入 0.05、0.15、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 mL;3%Gly 水溶液加入量 0、1、2、3 mL;濃 H3PO40、1、2、3 mL。測定513 nm處吸收值。

1.2.6 響應面法優化SNP法 以單因素實驗結果為依據，采用Box－Behnken中心組合實驗設計，對SNP法響應面優化。實驗設計見表1，重復3次。測定前用水補足體積，每個樣加完試劑后總體積為10.3 mL。

表1 SNP法響應面設計因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment for SNPmethod

1.2.7 分析Gly、His的存在對SNP反應吸收光譜的影響 無菌發酵培養基中加入1 g/L的Met，或加入1 g/L Met+1 g/L His，兩種混合液作為樣品。依1.2.6得出的最佳SNP法不加甘氨酸，測定掃描光譜;依1.2.6得出的最佳SNP法，但加入2 mL 3%甘氨酸，測定掃描光譜。比較四條吸收光譜曲線。

1.2.8 標準曲線制定 配制 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 g/L 的 Met，掃描 SNP 反應結束后產物光譜。記錄吸收值的變化，利用Originpro 8繪制標準曲線。

1.3 數據分析

經紫外可見分光光度計測定的數據，保存為txt文件，利用Originpro 8繪制各類相關圖。利用Design－expert 7.0軟件設計響應面實驗方案并分析實驗結果。

2 結果與分析

2.1 發酵液中不同氨基酸SNP法反應吸收光譜

文獻報道中，利用SNP法測定Met含量時，會受到 His、Cys、Tyr 等氨基酸的影響［15］。為能在發酵液中準確判斷和定量Met，需要確定發酵液中存在哪些干擾氨基酸，并分析影響程度。理論上，Met合成通路中，從 Asp 開始，會形成 Lys、Thr、Ile、Cys、Ser等［17］。發酵液經全自動氨基酸分析儀分析，蠟樣芽孢桿菌發酵液中氨基酸種類為 Thr、Ser、Gly、Ala、Met、Val、Ile、His、Lys、Arg 等。圖 1 揭示了這些氨基酸SNP反應后的吸收光譜。SNP實驗過程中，不加入H3PO4時，試管中溶液顏色不發生變化。Met的SNP反應中只有加入H3PO4后，溶液顏色才會出現紅色。結果表明除了Met外，只有Tyr、His、Cys吸收光譜會出現新的吸收峰。SNP反應結束后，吸收光譜中His與Met的最大吸收峰比較接近，Met的最大吸收峰處波長為513 nm，His的最大吸收峰處于402 nm與486 nm處。Cys、Tyr的最大吸收峰出現在350 nm左右，且Tyr此處峰值不大。其它氨基酸都沒有出現新的吸收峰。因此，若想排除其它氨基酸對Met測定的影響，可以只考慮His的影響。

2.2 培養基成分對測定的影響

圖1 不同氨基酸硝普鈉反應吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of sodium nitroprusside reaction with different amino acid

測定發酵液中Met含量時，培養基中營養成分分別和SNP進行反應，可以確定這些成分是否會對測定產生影響。圖2明顯可以看出，培養基成分葡萄糖、MgSO4、(NH4)2SO4等在513 nm雖然會有小于0.4的吸收值，但其顏色都屬于黃色系列，未出現紅色。消除影響的方法為利用無菌的空白培養基，按需加入各種試劑，反應結束后作為對照。所以培養基中的其他成分對硝普納法分析Met的含量影響不大。需要避免的一點是，在配制培養基時，碳源最好單獨配好、滅菌，之后無菌加入到其它成分的培養基中。最好保持培養基本身沒有的顏色，以避免影響判斷。如果培養基無可避免的有顏色，比如需要加入酵母膏，可以通過直接掃描光譜，分析在513 nm處是否出現吸收峰。雖然培養基中有些成分，在此會有吸收值，但不會出現吸收峰(圖2)。通過計算峰高值(以513 nm左右處的基線為準)，確定發酵液中Met含量。

圖2 發酵培養基中各成分硝普鈉反應吸收光譜Fig.2 Absorption spectra of sodium nitroprusside reaction with different components of the broth

2.3 SNP法各試劑的反應時間對吸收光譜的影響

通過依次加入各試劑，反應不同時間，測定掃描光譜，分析 NaOH、SNP、Gly、H3PO4各試劑在 SNP 法測定蛋氨酸所起的作用。如圖3所示，隨著加入NaOH與SNP后的反應時間的延長，395 nm處吸光值不斷下降(反應 2、3、4、5、6、7、8、10、30 min 的吸收光譜曲線，因與9、20 min的吸收光譜曲線趨勢一致，故省略)。Ahmed等［16］實驗證明SNP在堿性條件下反應生成［Fe(CN)5NO2］4－離子，吸收峰在400 nm 左右，與本實驗中395 nm處吸收峰接近，吸收峰下降，說明反應液中［Fe(CN)5NO2］4－離子隨著反應時間的延長，離子形式或量在發生變化。

圖3 蛋氨酸的硝普鈉反應中依次加入各試劑并反應不同時間對吸收光譜的影響Fig.3 Absorption spectra of methionine with reagents of sodium nitroprusside reaction for different time

為確定加入NaOH與SNP后靜置時間對最終反應結束后513 nm處吸光值的影響，設計了相應的實驗，結果見圖4。3種濃度的Met SNP法反應后吸光值趨勢一致，隨著靜置時間的延長，A513nm先升高后穩定，反應30 min后出現平穩的趨勢。所以后面實驗中，靜置時間設定為30 min。

圖4 樣液中加NaOH與硝普鈉后放置時間對吸收值的影響Fig.4 The effect of reaction time after addition of sodium hydroxide and sodium nitroprusside reagents

圖3中反應30 min后加入Gly，吸收光譜曲線形狀無明顯改變，只是500 nm以下的吸收值在不斷下降。圖中省略了反應2、3、4、5、6、7、8、10 min 吸收光譜圖，吸收光譜曲線趨勢與反應1、9 min時的一致，10 min的吸收光譜曲線與反應9 min的基本重合。加入H3PO4后，峰形很快出現變化，最大吸收峰出現在513 nm處，說明形成新的物質。反應1 min或反應40 min，曲線接近重疊，即時間的延長毫無意義(圖3省略了其它反應時間，因與1 min時的吸收光譜幾乎重疊)。綜上所述，加入NaOH與SNP后，反應30 min;加入Gly后，反應時間10 min;加入H3PO4后，反應1 min后，吸收光譜已基本無變化，但為了方便測定，反應時間統一為5 min。

2.4 SNP法中試劑添加量對吸收值的影響

圖5 ～6是SNP反應過程中各加入試劑的量對吸光值的影響。結果顯示，Gly、5 mol/L NaOH、SNP、H3PO4四種試劑的添加量對SNP反應均有影響。H3PO4與NaOH不加入時，513 nm處沒有吸收峰出現，吸收值為0。說明SNP反應中，必須加入H3PO4與NaOH。但H3PO4的添加量大于1 mL時，吸光值基本不變;5 mol/L NaOH加入量大于0.5 mL后，吸光值明顯下降，可能與多余的NaOH改變液體離子電荷有關;Gly的加入使吸收值一直在下降。圖6表明，3種濃度 Met的 SNP法反應的吸光值均隨著10%SNP添加量的增加呈現出先上升后平穩的趨勢。當添加量大于0.25 mL時，當Met含量為0.25 g/L時，吸光值有輕微下降趨勢;而濃度為0.5、0.75 g/L，吸光值仍在上升，且二者吸光值接近。為了響應面數據更準確，將SNP添加量選擇在0.15與0.30 mL中間。所以，在響應面設計中以Gly、5 mol/L NaOH、SNP為變量，中心點分別為 1.0、0.5、0.22 mL。

圖5 三種試劑的添加量對蛋氨酸－硝普鈉反應的影響Fig.5 The effect of the addition of three reagents on the reaction of methionine with sodium nitroprusside reagents

圖6 硝普鈉添加量對吸收值的影響Fig.6 The effect of the addition of sodium nitroprusside on the reaction

2.5 響應面優化SNP法

整個反應是連續的，為了使量更確定，做了三因素的響應面分析(表1～3)。通過響應面分析得出A513nm=0.83+4.28A－4.24B－0.72C－0.82AB－0.51AC－0.21BC－2.64A2+10.32B2+0.29C2(A、B、C 均為實際值)。模型方差分析，p為0.0053＜0.01極顯著，失擬項概率0.2913＞0.05，說明無失擬因素存在。R2校正值為0.8054(＞0.8)，與R20.9149相近，說明回歸效果較好，能夠預測不同反應試劑量下，SNP法吸收值的大小。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of the response surface experiment

表3 響應面方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface experiment

表3說明，NaOH與Gly對吸光值的影響極其顯著(p＜0.01)，不可忽視;三個因素間的交互影響不顯著(p＞0.05)。圖7顯示出NaOH的影響存在最高值，此時5 mol/L NaOH的量約為0.6～0.9 mL，與單因素實驗的趨勢相似;3%Gly水溶液(圖7(b))對吸光值的影響也極顯著，最佳添加量趨于0 mL，與單因素實驗結果相同;而10%的SNP試劑(圖7(a))的添加量在0.14～0.30 mL之間對吸光值的影響不大，與單因素實驗略有出入。

圖7 響應面分析等高線圖Fig.7 The contour graphics of response surface design

利用Design－expert軟件，根據響應面數據計算最佳條件，得出SNP法測定最佳條件為:5 mol/L NaOH添加量為0.74 mL，10%SNP添加量為0.15 mL，3%Gly添加量為0 mL，預測的A513nm為2.059。經實驗驗證，1.0 g/L Met經優化后的SNP法測定，A513nm均值為1.952，與預測值接近。

2.6 Gly對Met吸收光譜的影響

圖8分析比較了測定Met吸收光譜時，Gly對吸收光譜的影響。加入Gly時，無論樣品中是否含有His，513 nm處的吸收峰值都明顯變小。而且發酵液中同時存在Met與His，加入Gly時，其吸收值降得更低。總之，Gly的存在，不僅會降低His與SNP反應的吸收值，也會降低Met與SNP反應吸收值，所以依靠Gly消除His的影響的同時，也會降低測定Met的靈敏度。

為消除His的影響，1970年Smith等在反應過程中加入Gly［14］。圖8中，單獨存在 Met時，最大吸收峰出現在513 nm處，單獨存在His時，最大吸收峰出現在486、402 nm 處(圖1(a))，Met與 His混合時，最大吸收峰出現在510 nm處。由此可以說明，如果有其它試劑的干擾，最大吸收峰會發生藍移，實驗時，可將Met標準品相同條件下與SNP試劑反應結果作為標準，進而確定結果。

圖8 甘氨酸對蛋氨酸硝普鈉反應吸收光譜的影響Fig.8 The affection of glycine on the absorption spectra of methionine after reaction with sodium nitroprusside

2.7 標準曲線的繪制

通過測定不同濃度的Met與SNP反應后其最大吸收峰及吸收值的大小。圖9兩張圖表明0～1.4 g/L不同含量的Met在513 nm處的吸光值出現由小到大的線性關系。當濃度為1.2 g/L時，吸光值已經大于2.0。當濃度＞1.6 g/L時，吸光值大于3.0，且513 nm處吸收峰出現明顯波動(圖9(a))。為了檢測準確，濃度范圍盡量選擇在0～1.0 g/L。

圖9 不同濃度蛋氨酸硝普鈉反應的吸收光譜與標準曲線Fig.9 The standard curve of methionine with sodium nitroprusside reaction

3 結論

SNP法測定發酵液中Met含量時，其中Gly的加入，不僅會降低His與SNP反應后的吸收值，同時會降低Met和SNP反應后的吸收值。利用掃描光譜的方式，可以發現，樣品中如果存在His，吸收峰會出現藍移。證實可利用SNP法排除其它氨基酸的干擾，測定發酵液中是否含有Met。通過單因素實驗和響應面試驗，優化了SNP法中各試劑添加量與反應時間。結果為:發酵液1500×g離心15 min，5 mL上清液中加入0.74 mL 5 mol/L NaOH和0.15 mL 10%SNP溶液，搖勻試管，放置30 min;將2 mL濃H3PO4逐滴加到混合物中，振蕩試管，反應5 min，在513 nm處測吸收值。

用SNP法測定發酵液中Met含量:先利用紫外分光光度計掃描光譜，判斷最大吸收峰的位置。確定有Met時，利用優化后的SNP法測定發酵液中Met含量。為了增加SNP反應的靈敏度，不加Gly。菌種篩選時，利用此方法可以迅速分辨出哪些菌株是Met高產菌株。此測定方法具有被廣泛使用的價值。