Prefoldin 1對乳腺癌BT474細胞上皮-間充質轉化的影響

黃超有 李璽 韓錚 朱珊珊

1廣州市番禺區何賢紀念醫院乳腺甲狀腺外科（廣州 511400）；2中山大學附屬第三醫院乳腺甲狀腺外科（廣州 510630）

乳腺癌是國內女性最常見惡性腫瘤，嚴重威脅女性身心健康［1］，其發生、發展及轉歸受到多種因素調控，上皮?間充質轉化（epithelial?mesenchy?mal transition，EMT）是其中重要因素［2］。EMT 可顯著促進腫瘤局部浸潤和遠處轉移［3］，其還與腫瘤化療耐藥和腫瘤干細胞形成密切相關［4］。研究表明Prefoldin（PFDN）亞型PFND1直接參與調控細胞骨架重排［5］，而細胞骨架重排又是EMT的重要環節［6］，但PFND1是否對乳腺癌癌細胞EMT過程產生影響未見報道。本研究擬以乳腺癌BT474細胞株為材料，PFND1對乳腺癌癌細胞EMT過程的影響，報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器乳腺癌BT474細胞株，購自中科院上海細胞生物研究所；pLKO.1慢病毒表達載體，購自美國 Sigma；PrimeScript?RT reagent Kit（Perfect Real Time）、SYBR?Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus），購自日本TaKaRa；羊抗人PFDN1多克隆抗體，購自美國Santa Cruz；鼠抗人GAPDH單克隆抗體、兔抗人E?cadherin抗體、兔抗人N?cad?herin抗體、兔抗人vimentin抗體，購自美國CST公司；Western一抗稀釋液、Western一抗二抗去除液，購自碧云天生物；聚碳酯膜（PC）Transwell?嵌套（24孔板專用），購自美國 corning；LEGEND MI?CRO17離心機、LEGEND MACH 1.6R離心機，購自美國Thermo；-80℃超低溫冰箱，購自日本SANYO；M5多功能酶標儀，購自美國Molecμlar Devices；7500型實時熒光定量PCR系統，購自美國ABI。

1.2 實驗方案

1.2.1 細胞培養BT474細胞培養于含10%胎牛血清和1%青、鏈霉素的RPMI?1640培養基，并置于37℃5%CO2細胞培養箱。

1.2.2 慢病毒真核表達載體構建使用pLKO.1慢病毒表達載體構建pLKO.1?sh?PFND1，并設1種對照片段，包裝生產相應的慢病毒，感染BT474細胞株。根據載體種類將轉染實驗分成3組：轉染組，由含干擾片段質粒轉染；空白轉染組，由含對照片段質粒轉染；未轉染組，不進行轉染操作。

1.2.3 細胞侵襲和遷移能力檢測取對數生長期細胞，血清饑餓過夜，胰酶消化后以無血清RPMI?1640重懸為單細胞懸液，濃度為1.0×105/mL及1.0×104/mL，分別用于Transwell侵襲和遷移實驗。

1.2.4 PFDN1及EMT標志分子mRNA表達情況提取總RNA，逆轉錄為cDNA，采用Real?time PCR 檢測PFDN1、E?cadherin、N?cadherin、Vimentin mRNA。根據2-△△CT方法計算各待測mRNA相對于內參的相對表達量。

1.2.5 PFDN1及EMT標志分子蛋白表達情況提取總蛋白，測定蛋白濃度后，電泳、轉膜，采用Western blot法檢測PFDN1、E?cadherin、N?cadherin、Vimentin蛋白。以各蛋白條帶灰度值/GAPDH灰度值代表各蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法采用SPSS 25.0處理數據，各實驗均重復3次，計量資料按（）表示。多組間對比采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 穩定低表達PFDN1的BT474細胞系驗證與未轉染組對比，轉染組PFDN1 mRNA及蛋白表達明顯下降（P＜0.05），空白轉染組PFDN1 mRNA及蛋白表達無明顯變化（P＞0.05）。見表1。

表1 3組BT474細胞系PFDN1 mRNA及蛋白表達情況對比Tab.1 Comparison of PFDN1 mRNA and protein expression in three groups（n=3） ±s

表1 3組BT474細胞系PFDN1 mRNA及蛋白表達情況對比Tab.1 Comparison of PFDN1 mRNA and protein expression in three groups（n=3） ±s

注：與轉染組對比，*P＜0.05；與空白轉染組對比，#P＜0.05

組別PFDN1 mRNA PFDN1蛋白轉染組空白轉染組未轉染組F值P值0.42±0.02 0.67±0.29*1.00±0.00*25.463 0.001 0.70±0.11 4.04±0.17*4.40±0.20*#451.233 0.000

2.2 3組細胞系侵襲及轉移能力對比細胞侵襲實驗中，轉染組細胞穿過小室膜的細胞數為（28.33±4.16）個，空白轉染組為（77.33±6.51）個，未轉染組為（81.00±8.00）個，轉染組上述細胞數明顯低于空白轉染組及未轉染組（P＜0.05），見圖1。細胞遷移實驗中，轉染組穿過小室膜的細胞數為（22.33±2.08）個，空白轉染組為（34.00±2.65）個，未轉染組為（37.00± 3.61）個，轉染組上述細胞數明顯低于空白轉染組及未轉染組（P＜0.05）。見圖2。

圖1 3組Transwell侵襲實驗檢測結果（×200）Fig.1 Transwell invasion test in three groups

2.3 3組細胞EMT標志分子mRNA表達轉染組E?cadherin mRNA表達水平明顯高于空白轉染組和未轉染組，N?cadherin mRNA和Vimentin mRNA表達水平明顯低于未轉染組（P＜0.05）。見表2。

2.4 3組細胞EMT標志分子蛋白表達轉染組E?cadherin蛋白水平明顯高于其他兩組，N?cad?herin、Vimentin蛋白水平明顯低于其他兩組（P＜0.05）。見圖3、表3。

圖2 3組Transwell遷移實驗檢測結果（×200）Fig.2 Transwell migration test in three groups

表2 3組細胞EMT標志分子mRNA表達情況對比Tab.2 Comparison of expression of EMT marker mRNA in three groups（n=3） ±s

表2 3組細胞EMT標志分子mRNA表達情況對比Tab.2 Comparison of expression of EMT marker mRNA in three groups（n=3） ±s

注：與轉染組對比，*P＜0.05

組別轉染組空白轉染組未轉染組F值P值E?cadherin mRNA 5.33±2.31 1.33±0.58*1.00±0.00*9.235 0.015 N?cadherin mRNA 0.25±0.00 0.75±0.43 1.00±0.00*7.000 0.027 Vimentin mRNA 0.42±0.14 0.67±0.29 1.00±0.00*7.400 0.024

表3 3組細胞EMT標志分子蛋白表達Tab.3 Comparison of expression of EMT marker proteins in three groups（n=3） ±s

表3 3組細胞EMT標志分子蛋白表達Tab.3 Comparison of expression of EMT marker proteins in three groups（n=3） ±s

注：與轉染組對比，*P＜0.05

組別轉染組空白轉染組未轉染組F值P值E?cadherin 蛋白1.25±0.08 0.58±0.07*0.54±0.06*96.101 0.000 N?cadherin 蛋白0.61±0.07 0.94±0.06*1.07±0.10*27.357 0.001 Vimentin蛋白0.47±0.08 0.91±0.14*1.13±0.17*18.514 0.003

圖3 3組細胞EMT標志分子蛋白表達情況對比Fig.3 Comparison of expression of EMT marker proteins in three groups

3 討論

腫瘤侵襲與轉移是導致乳腺癌治療失敗和轉移復發的重要原因，一旦發生轉移，乳腺癌患者生存率明顯下降［7］。如何降低乳腺癌早期復發及遠處轉移風險，是我們的研究的重要課題。

EMT是影響腫瘤侵襲轉移能力的重要因素，在乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤侵襲轉移過程中，均能夠發現EMT現象［8-9］。EMT過程中，細胞發生形態學變化，極性消失，細胞骨架重排，細胞侵襲和遷移能力增加［10］，此過程常伴隨一系列標志分子的變化，包括上皮表型標志分子E?cadherin下降，間質表型標志分子N?cadherin、Vimentin等上升［11］。本研究構造穩定低表達PFDN1的轉染組，顯示轉染組E?cadherin表達水平明顯高于空白轉染組及未轉染組，而N?cadherin、Vimentin表達水平明顯低于空白轉染組及為轉染組，提示PFDN1可能與乳腺癌EMT有關。經Transwell細胞侵襲及遷移實驗，也能夠證實抑制PFND1表達，乳腺癌細胞侵襲和遷移能力明顯下降。

PFDN是一組輔助伴侶蛋白，既往多項報道證實該組蛋白與腫瘤進展有關：FAROOQ等［12］指出其在HepG2肝癌細胞株中，與組蛋白去乙酰化酶1有高親和力，而后者有誘導肝癌細胞凋亡的作用；PFDN4在結直腸癌組織中低表達，且與腫瘤細胞侵襲能力有關［13］；RIESTER等［14］報道顯示尿路上皮癌患者PFDN2高表達多預示著較差的預后；本研究前期也觀察到乳腺癌組織中PFDN1表達明顯強于正常乳腺組織。針對腫瘤細胞EMT的報道還顯示，PFDN1與肺癌細胞［7］、結直腸癌［15］細胞EMT過程有關，本研究則提示PFDN1還與乳腺癌EMT過程有關。上述既往報道推測PFDN1主要通過影響細胞骨架重組，進而影響EMT過程。PFDN1的主要功能是捕獲未折疊多肽，協助其折疊并將其傳送至CCT，除底物傳送功能外，其還可以提高肌動蛋白和微管蛋白折疊的效率，這是因為PFDN1還能夠將部分折疊的底物分子返回至CCT，以實現下一循環的折疊，故缺乏PFND1可能導致肌動蛋白和微管蛋白折疊效率下降。而微管是細胞骨架的主要成分之一，這說明PFND1對細胞骨架重組效率有一定促進作用，細胞骨架重組又是EMT的關鍵過程，因此PFND1可能通過影響細胞骨架重組，進而影響乳腺癌EMT過程。

綜上，PFDN1能夠促進乳腺癌BT474細胞EMT轉化，抑制PFDN1表達可能有助于抑制乳腺癌EMT過程。但本研究僅為體外研究，可能并不足以證實PFDN1對乳腺癌癌細胞EMT的影響，仍需后續研究補充。