單純皰疹病毒1型US11蛋白結合DNA甲基轉移酶3A的作用研究

鐘霞 潘建華 童堅

1海口市人民醫院檢驗科（海口 570208）；2海南醫學院附屬醫院外科（海口 570102）

單純皰疹病毒1型（herpes simplex virus type 1，HSV?1）是一種分布廣泛，易引起人群感染的病原體。其轉錄翻譯的蛋白質根據功能可分為“必需蛋白”（對病毒基因表達、DNA合成和病毒顆粒組裝必不可少的蛋白質）和“非必需蛋白”（允許病毒在各種極端條件下仍保持病毒性）［1］。US11是“非必需”病毒包膜蛋白之一，存在于感染細胞的細胞核和細胞質中，卻對HSV?1病毒在熱應激或熱休克處理過的細胞中的存活起著至關重要作用［2］。作為一種RNA結合蛋白，US11識別結合序列和構象特異的RNA，從而在基因轉錄后發揮調控作用。同時，US11還可直接與宿主蛋白相互作用，從而達到抵抗宿主防御功能的作用。

目前盡管確定了US11能和宿主蛋白：核蛋白、蛋白激酶2和蛋白激酶R相互作用，但對這種相互作用的認識還處在初級階段［3］。研究發現與病毒蛋白相互作用的宿主蛋白對了解病毒感染過程中發生的生化反應，以及抗病毒的治療研究有重要的意義。而在先前的研究中，顯示經綠熒光蛋白（GFP）標記US11的HSV?1 KOS病毒株用于感染人包皮成纖維細胞（HFF）細胞具有與未標記野生型菌株［4］相當的感染性和滴度（圖1）。基于此，本研究采用熒光標記的HSV?1病毒感染人成纖維細胞（HFF），結合免疫共沉淀（co?immunoprecipitation，IP）對US11及其相互作用蛋白提取和純化，并聯合質譜（mass spectrometry，MS）法、蛋白質印跡（Western blot）篩查、鑒定與US11蛋白存在相互作用的宿主候選蛋白，幫助更深入地解析US11的生物學功能，現報道如下。

1 材料和方法

圖1 GFP標記US11的病毒基因組位點示意圖Fig.1 Schematic of viral genome locus where US11 was tagged with GFP

1.1 抗體和試劑琥珀酰亞胺基辛二酸酯（suberic acid bis?N?hydroxysuccinimide ester，DSS）、蛋白 A珠、Triton X?100和蛋白酶抑制劑混合物，EDTA、ECL蛋白質印跡底物和BCA蛋白質測定試劑均購自美國Sigma公司。PBS和MOPS SDS運行緩沖液購自北京雷根生物技術有限公司。兔抗US11多克隆抗體購自Santa Cruz公司。Tris?HCl（pH 7.4），兔血清，抗兔IgG過氧化物酶二抗購自艾美捷科技有限公司。

1.2 細胞培養、病毒株和感染HSV?1 KOS菌株（由海南醫學院惠贈）在其N?末端用GFP標記US11，在天然啟動子作用下，具有相當于野生型菌株的表達水平。使用HSV?1菌株17作為對照，以確定US?11（GFP）在細胞中的定位。KOS菌株和菌株17均為野生型HSV?1，已被廣泛地用來研究HSV?1的復制、基因表達和致病機制。兩者對于HFF細胞的感染率相似，但前者的病原性小于后者。對在DMEM培養基中生長的HFF人包皮成纖維細胞（由本實驗室保存）進行感染來繁殖病毒原種，以MOI=5 pfu/mL進行細胞感染，將感染后的細胞培養72 h，通過刮取培養基而收獲。將收集的細胞凍融并超聲處理以從細胞質中釋放病毒顆粒。使用蛋白質印跡法（Western blot）評估穩定細胞系中US11的表達水平。

1.3 免疫共沉淀（IP）使用GFP?US11 HSV?1或對照菌株感染HFF細胞，并使用抗GFP綴合的磁珠，在培養72 h后刮下細胞收集于硫酸葡聚糖鈉鹽（DSS）中，加入Triton X?100和蛋白酶抑制劑混合物，離心后取100 μL細胞沉淀懸浮，然后逐滴液氮冷凍，研磨混勻，每個樣品總共回收0.8 g冷凍細胞粉末，加入含有20 mmol/L HEPES?KOH、0.1 mmol/L醋酸鉀、2 mmol/L MgCl2、0.1% 吐溫-20、1 μmol/L ZnCl2、1 μmol/L CaCl2、250 mmol/L NaCl和1%Triton X?100和蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液。將兔抗US11多克隆抗體與蛋白A珠在4℃溫度下孵育1 h，然后用抗體偶聯珠對US11及其相互作用蛋白提取純化，用于實驗。

1.4 Western blot分析樣品凝膠電泳后轉移至PVDF膜上，并在含有5%牛奶、0.1%吐溫20、50 mmol/L Tris和150 mmol/L NaCl的緩沖液中封閉1 h，與一抗（1∶1 000）在4℃溫度下孵育過夜，然后二抗室溫下孵育1 h。再將印跡與ECL檢測試劑一起溫育5 min，使用ECL使蛋白質可視化。平行分析正常IgG對照樣品以區分非特異性結合蛋白。

1.5 質譜分析（MS）將洗脫的樣品加載到Nu?PAGE 4?12%Bis?Tris凝膠上，凝膠以藍考馬斯染料染色，切片在50 mmol/L碳酸氫銨、50%乙腈中脫色，然后進行三輪脫水和再水化步驟。樣品與12.5 ng/μL測序級胰蛋白酶在37℃下孵育過夜。將50%乙腈/0.5%甲酸溶液加入到凝膠片中并在室溫下溫育4 h提取肽。通過nLC?MS/MS對樣品分析，儀器為LTQ?Orbitrap Velos ETD質譜儀偶聯Dionex Ultimate 3000 RSLC（美國Thermo公司）。將肽加載在捕獲柱（Magic C18 AQ，3 μm，100 μm×2.5 cm；美國Bruker公司）上，以0.5%三氟乙酸-1%乙腈-98.5%水作為流動相，以5 μL/min流速脫鹽5 min，用反相色譜（Acclaim PepMap RSLC C18，1.8 μm，75 μm×25 cm）以 250 nL/min流速分離 120 min。質譜儀在數據相關采集模式下運行，在LTQ?XL離子阱中獲得10個數據相關的最強烈離子的MS/MS譜圖，標準化能量為35。對已經破碎的前體離子動態排除，參數包括：排除時間180 s，重復計數1，重復持續時間30 s，排除質量寬度10 ppm，排除大小500。

1.6 統計學方法通過Proteome Discoverer（版本1.3；美國Thermo公司）處理含有每種生物樣品的MS/MS譜圖的原始文件，對UniProt、SwissProt序列數據庫（包含人類、皰疹病毒和污染物等132 670個序列）進行檢索。使用以下參數搜索從正向和反向蛋白質序列條目產生的肽數據庫的譜：最多兩個缺失的裂解，完整的酶特異性，固定修飾氨基甲酰甲基半胱氨酸（+57 Da），可變乙酰基賴氨酸（+42 Da）和甲硫氨酸氧化修飾（+16 Da）。肽和蛋白質概率通過Peptide Prophet和Protein Prophet算法計算。為了將假陽性鑒定減少至＜1%，概率過濾器設定為至少一個生物樣品中的每個蛋白質具有99%的蛋白質置信度，95%的肽置信度和兩個獨特的肽。將蛋白質組和未加權的光譜計數輸出到 Excel［5-6］。

2 結果

2.1 GFP?US11 HSV?1感染HFF細胞使用共聚焦免疫熒光法，GFP標記用于觀察感染后4個時間點US11的位置。GFP?US11僅在感染后12 h定位于細胞核，呈離散點滴狀分布（圖2）。US11的核定位預計在感染階段。在感染后16 h時，US11仍然位于細胞核，在20 h時，US11從細胞核初始流出到細胞質中，并且在24 h時，其顯現遍布于細胞質。

圖2 GFP?US11 HSV?1在感染包皮成纖維細胞（HFF）后四個不同時間的位置Fig.2 Localization of GFP?US11 at four different hours with HSV?1 in primary human foreskin fibroblasts（HFF）

2.2 HFF細胞核中與US11相互作用的蛋白在使用或不使用交聯劑進行共IP實驗后，通過West?ern Blot分析評估分離的有效性。如預期那樣，沒有DSS交聯，在IP樣品中檢測到重鏈和輕鏈以及IgG片段。DSS的使用完全消除了抗體污染（圖3A），表明US11抗體通過DSS交聯成功固定在蛋白質A珠上。

對固定化抗體孵育裂解物后流通部分中的US11（即未結合的US11）評估，顯示在流通級分中檢測到DSS交聯和不存在DSS交聯的未結合US11相當（圖3B，第三和第四泳道），提示本研究使用的DSS濃度進行固定不會明顯改變US11的抗原結合能力。

2.3 DNA甲基轉移酶3A（DNA methyltransferas?es 3A，DNMT3A）是一種新型的US11相互作用蛋白在感染后16 h時與GFP?US11共分離出幾種潛在宿主蛋白質（表1）。用GFP?US11 HSV1感染這些細胞，通過標記分離DNMT3A，利用Western blot分析，觀察見GFP?US11與DNMT3A共分離，但與IgG控制無關（圖4A）。用野生型HSV?1感染DMNT3A?GFP?FLAG表達細胞，使用質譜法證實未標記的US11與DNMT3A?GFP共分離（圖4B）。證實這種關聯不是US11或DMNT3A標簽的產物。

圖3 利用IP純化US11相互作用蛋白Fig.3 Purification of US11 interacting protein by IP

3 討論

US11蛋白是一種21 kDa的高度堿性磷酸化蛋白，也是一種RNA結合蛋白，具有調節基因表達作用［7］。最近的報道［8］強調病毒感染調節宿主表觀遺傳因子，影響病毒和宿主基因的表達并創造有利于病毒復制的環境，因此這種關聯是有意義的。因此，本研究將重點放在這個關聯上。研究成功分離出HSV?1病毒的US11蛋白，并通過系統研究與US11相互作用的蛋白，檢測其潛在功能和調控作用。

表1 MS鑒定出與US11潛在相互作用的蛋白Tab.1 MS identified the protein potential interaction with US11

圖4 宿主DNMT3A與HSV?1 US11的相關性Fig.4 The correlation between the host DNMT3A and the HSV?1 US11

本研究設計了數個驗證實驗，在交替標記的系統中使用交互分離，以確認實驗中觀察到的US11?DNMT3A相互作用。首先，研究培養了一個HFF細胞系，該細胞系穩定表達DNMT3A，具有雙重標記：FLAG和GFP。其次，以往對US11在HSV?1感染期間的研究主要集中在其最初轉移到細胞核或感染后期的功能上（如裝配）［9］。因此本研究主要對US11從細胞核流出之前的相互作用進行了研究，選擇感染后16 h時間點進行US11蛋白相互作用的免疫親和分離和蛋白質組分析。在IP過程中，為了減少來自抗體的干擾，本研究選擇不可裂解的二琥珀酰亞胺辛二酸酯（DSS）交聯劑，永久性地將US11抗體綴合在蛋白質A珠上。

對感染后16 h的US11蛋白關聯的分析顯示，病毒蛋白的相互作用具有不同的關聯強度。形成衣殼的蛋白質被預測會以高度有序和嚴格的構象結合。因此，即使在裂解條件下，它們與US11共同分離也就不足為奇了。已知在衣殼表面上存在pUL25衣殼蛋白，并直接與內部被膜蛋白pUL36結合［10］。本研究的IP?MS分析結果顯示pUL17是與US11相互作用的蛋白質，這是一種具有衣殼成熟和運輸核功能的病毒蛋白。例如，pUL17屬于子復合物的一部分，即衣殼特異性成分，它也包含pUL25和pUL36，可能具有穩定基因調控病毒衣殼的功能［11］。先前的研究表明，pUL17和pUL14可以影響US11的定位，但沒有證據表明這些蛋白與US11或其他HSV?1蛋白相關。由于這些蛋白在裂解條件下要么不存在，要么大量減少，因此它們與US11的關聯很可能是間接的。

本研究中試圖通過在感染期間鑒定其與宿主因子的關聯來獲得對HSV?1中RNA結合蛋白US11功能的進一步見解。雖然鑒定了幾種潛在宿主蛋白質，但本研究選擇關注其與DNMT3A的關聯進一步分析，因為已知來自不同家族的病毒利用甲基轉移酶進行高效復制，特別是HBV和KSHV共同選擇DNMT3A［12-13］。在發育和腫瘤發生的情況下，DNMT3A的水平與細胞增殖相關，據報道DNMT3A在正常肝細胞中表達水平低，但在肝細胞癌細胞（HCC）中水平升高，敲除DNMT3A基因減少了這些HCC細胞系中的細胞增殖和集落形成［14］。目前，還沒有證明HSV?1靶向DNMT3A。通過使用免疫親和純化、質譜和Western blot分析，本研究建立了US11和DNMT3A在人成纖維細胞中的聯系。這些結果表明US11和DNMT3A在HSV?1感染期間在細胞核中相互作用。

雖然本研究認為所使用的DSS濃度固定對US11的抗原結合能力沒有明顯改變，但免疫共沉淀方法畢竟不能區分直接和間接的相互作用。因為抗體-抗原結合依賴于特定的結構識別，抗體的活性取決于尖端結構或抗原結合位點，將抗體固定到蛋白質A珠時通過交聯可能改變尖端結構。盡管數千種抗體具有一般結構，但尖端結構略有不同。DSS交聯仍可能影響抗體-抗原相互作用，掩蓋可能與抗原結合的互補位，影響免疫沉淀效率［15］。因此，無法徹底排除其他與US11結合的病毒或宿主蛋白可能介導與DNMT3A的聯系。例如較大的衣殼蛋白VP5或病毒DNA結合蛋白ICP8。盡管如此，本研究首次證明DNA甲基轉移酶在HSV?1感染過程中具有功能性作用。

在這項研究中，免疫共沉淀聯合質譜分析篩查與HSV?1病毒US11蛋白存在潛在相互作用的宿主蛋白。使用這種方法，DNMT3A被定性為一種新的US11結合蛋白，揭示了US11在感染過程中潛在的新作用。這不僅為進一步研究相關分子機制開辟了新的研究途徑，同時為治療抗病毒干預提供了可能的新靶點。