甲基轉移酶3在前列腺癌中的表達及其臨床意義

李顯永 官潤云 柯坤彬 顧鵬 李同海 崔慶鵬 陳印 趙暉

昆明醫科大學第一附屬醫院泌尿外科（昆明 650032）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）占據全球男性惡性腫瘤發病率第二位［1］。據估計，2018年全美將新增164 690例PCa，占男性新發腫瘤的19%［2］。我國PCa已是70歲以上人群致死率最高的泌尿系腫瘤，且其致死率正逐年上升，嚴重影響男性健康［3］。因此，對PCa發生、發展及診治策略的深入研究迫在眉睫。近年研究發現表觀遺傳學在腫瘤的發生、發展中扮演重要角色。N6?甲基腺苷（m6A）是指發生在腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修飾。它是真核生物mRNA中一種高豐度表觀轉錄組學修飾，據報道，人類有近7 600種mRNA以及超過300個非編碼RNA存在m6A修飾［4］。最新研究揭示m6A是一種動態可逆的RNA甲基化修飾，由甲基轉移酶復合體（METTL3、WTAP、MET?TL14），去甲基酶（FTO、ALKBH5），相應的閱讀蛋白（YTHDF、YTHDC）等協同調控［5］。METTL3作為催化RNA m6A修飾形成的甲基轉移酶復合體成員之一，目前已被證實在肺癌、肝癌和白血病等腫瘤疾病中呈高表達，并發現METTL3促進了腫瘤相關癌基因的翻譯，影響腫瘤的發生和進展［6-8］。而MET?TL3在PCa中的表達水平及其作用尚不清楚。本實驗擬通過TCGA數據集資料分析并運用Westren blot、IHC技術，從mRNA和蛋白水平來研究METTL3在PCa中的表達情況，并探索其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料本實驗調取2014年4月至2018年1月昆明醫科大學第一附屬醫院病理科PCa蠟塊32例和癌旁良性組織蠟塊29例，制作為厚度4 μm的連續切片，用于IHC檢測。其中年齡59～81歲，平均（66.09±5.49）歲；據2010年AJCC前列腺癌TNM分期標準，T1～T2期21例，T3～T4期11例；N0期27例，N1期5例；Gleason評分 ≤ 7分22例，＞7分10例。收集2018年2-4月昆明醫科大學第一附屬醫院行腹腔鏡下前列腺癌根治術切除的5例新鮮PCa和配對癌旁良性組織標本，依次編號為T1～T5，N1～N5，標本離體后迅速置入-80℃冰箱保存，用于Westren blot檢測。實驗前所有標本均由我院病理科HE染色證實為癌或癌旁良性組織；患者術前無長期內分泌治療及放化療史；并排除合并其他惡性腫瘤、免疫疾病、代謝疾病以及臨床資料不全者。于 TCGA 數據集（https：//portal.gdc.cancer.gov/proj?ects）下載PCa的mRNA數據和匹配的臨床資料，從中納入各項資料齊全的417例PCa以及52例配對癌旁的數據。本實驗經醫院倫理委員會審核批準。

1.2 實驗材料本實驗主要材料包括：DAB免疫組織化學顯色試劑盒（BBI）；兔抗人METTL3單克隆抗體（Abcam，英國）；HRP標記的兔二抗（BBI）；PBS（BBI）；兔抗beta?action多克隆抗體（Abcam，英國）；Tween?20（BBI）；蛋白提取試劑盒（上海生工）；BCA試劑盒（上海生工）；PVDF膜（廣州譽維生物）；發光試劑盒（上海生工）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化學方法所有切片依次行二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；檸檬酸三鈉抗原修復液，高壓鍋保壓4 min，冷卻至室溫，后PBS洗3次，各3 min；3%的過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育15 min，后PBS洗3次，各3 min；6%正常山羊血清，室溫封閉30 min；加兔抗人METTL3單克隆抗體（稀釋濃度1∶500），4°C濕盒中孵育過夜，后PBS洗3次，各3 min；加HRP標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育45 min，PBS洗4次，每次3 min；DAB顯色，顯微鏡下觀察控制染色時間，蒸餾水終止顯色；蘇木素復染5 min，1%的鹽酸酒精分化，PBST洗返藍；常規脫水、透明、封片；顯微鏡采圖。使用PBS代替一抗作陰性對照，按抗體說明書選用人膀胱癌組織作陽性對照。

1.3.2 免疫組化結果分析METTL3蛋白以細胞中出現棕黃色染色為陽性表達。所有切片在同一條件下隨機選取3個視野采圖。圖片使用image?pro?plus 6.0專業圖像分析軟件（美國Media Cybernetics公司）作免疫組化結果半定量分析［9-10］，圖片選擇腺體區域（排除間質和腺腔部分）測積分光密度（IOD）及面積（area），以平均光密度值（IOD/area，AOD）表示單位面積陽性程度，3個視野的平均AOD值代表METTL3蛋白的表達水平。

1.4 Western blot檢測取大約30 mg組織，加200 μL RIPA裂解液，低溫高速勻漿10 s，共3次，冰上裂解2 h，高速離心，吸取上清。二奎琳甲酸（BCA）法測定蛋白濃度，最終將濃度調整為5 μg/μL，加入5×的上樣緩沖液，沸水浴10 min變性。配制12%的分離膠，5%的濃縮膠。電泳后轉至PVDF膜，用5%的BSA?TBST封閉。分別與抗METTL3抗體（1∶1 000）和抗 β?action（1∶1 000）抗體溫室孵育15 min，4℃過夜。加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（1∶5 000），室溫 40 min。TBST洗膜5次，各3 min。加入增強型化學發光劑顯影3～5 min。曝光，定影，拍照。

1.5 統計學方法使用SPSS 20.0統計軟件作數據分析，結果數據以均數±標準差表示。實驗數據行正態性檢驗，組間比較采用配對或獨立樣本t檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 METTL3 mRNA在PCa和癌旁表達的差異TCGA數據集中52例PCa的METTL3 mRNA表達明顯高于配對癌旁組織［（7.718±2.151）vs.（5.700± 1.385）］，差異具有統計學意義（t=7.257，P＜0.01），見圖1。

圖1 52例PCa和配對癌旁組織METTL3 mRNA表達情況Fig.1 Expression of METTL3 mRNA in 52 cases of prostate cancer and adjacent tissues

2.2 METTL3蛋白在PCa和癌旁表達的差異IHC結果表明PCa和癌旁組織中METTL3蛋白的表達主要定位于細胞核，細胞質中少量表達。METTL3蛋白在PCa組織中表達水平明顯高于癌旁良性組織［0.074± 0.055）vs.（0.026±0.018）］，其差異有統計學意義（t=4.655，P＜ 0.01），見圖2。Western blot結果顯示METTL3蛋白在PCa中表達 量明顯高于配對癌旁良性組織，見圖3。

圖2 METTL3蛋白在不同組織中的表達情況Fig.2 Expression of METTL3 protein in different tissues

圖3 5例PCa和配對癌旁組織METTL3蛋白的表達情況Fig.3 Expression of METTL3 protein in 5 cases of prostate cancer and adjacent tissues

2.3 METTL3 mRNA和蛋白在PCa中表達水平與臨床病理特征的相關性Spearman等級相關分析發現，METTL3 mRNA表達水平與PCa的Gleason評分呈正相關（r=0.195，P＜0.01），而與年齡、T分期和N分期無相關性（P＞0.05），見表1；METTL3蛋白表達水平跟PCa的PSA值、Gleason評分呈正相關（r=0.381，P＜0.05；r=0.449P＜0.01），而與年齡、T分期、N分期無相關性（P＞0.05），見表2。

3 討論

METTL3最早是從Hela細胞裂解液中鑒定出的一個70 kDa的蛋白［11］，后續的研究發現其包含結合S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和催化m6A形成的兩個結構域，具有獨立催化RNA的m6A修飾形成的活性［12］。近期研究表明METTL3還可以與MET?TL4結合形成異質二聚體［13］，WTAP促進其在核斑點的定位，使其催化活性大大提升［14］。m6A是目前發現的100多種RNA轉錄后修飾中豐度最高的修飾方式［15-16］。m6A修飾在RNA中的定位主要存在Rm6ACH（R=G或A，H=A、C或U）這一共有序列［13］，運用高通量測序技術發現m6A峰分布在mRNA 的 3′非翻譯區（3′UTR）、5′非編碼區（5′UTR），內部外顯子、翻譯起始和終止密碼子附近區域［17-18］，鑒于其分布，進一步研究發現m6A可能對mRNA的剪切、3′端的加工、mRNA的出核，翻譯效率、mRNA的衰退以及對miRNA的加工發揮重要作用，從而影響多種生物學功能，包括：DNA損傷修復、晝夜節律、組織發育、性別的決定和腫瘤的發生［5，19］。

表1 TCGA PCa數據集METTL3 mRNA的表達與PCa臨床病理特征的相關性分析Tab.1 The relationship between the expression of METTL3 mRNA and clinical characteristics of prostate cancer in TCGA PCa dataset±s

表1 TCGA PCa數據集METTL3 mRNA的表達與PCa臨床病理特征的相關性分析Tab.1 The relationship between the expression of METTL3 mRNA and clinical characteristics of prostate cancer in TCGA PCa dataset±s

注：**在置信度（雙側）為0.01時，相關性是顯著的

P值例數METTL3 mRNA表達水平r值294 123特征年齡≤65歲＞65歲Gleason評分≤7≥8 T分期T1～T2 T3～T4 N分期8.486±2.608 8.596±2.269 0.0220.650 228 189 8.056±2.627 9.076±2.244 0.1950.000**143 274 8.331±2.416 8.616±2.557 0.0490.314 0.0570.242 N0 N1 339 78 8.450±2.514 8.815±2.489

表2 METTL3蛋白的表達與PCa臨床病理特征的相關性分析Tab.2 The relationship between the expression of METTL3 protein and clinical characteristics in prostate cancer±s

表2 METTL3蛋白的表達與PCa臨床病理特征的相關性分析Tab.2 The relationship between the expression of METTL3 protein and clinical characteristics in prostate cancer±s

注：*在置信度（雙側）為0.05時，相關性是顯著的；**在置信度（雙側）為0.01時，相關性是顯著的。PSA：前列腺特異性抗原。Gleason評分：PCa病理分級使用的評分系統

特征年齡≤65歲＞65歲Gleason評分≤7≥8 PSA≤20 ng/mL＞20 ng/mL T分期T1～T2 T3～T4 N分期例數METTL3蛋白表達水平AOD值r值P值18 14 0.080±0.045 0.065±0.066-0.1660.363 22 10 0.061±0.043 0.102±0.068 0.3810.031*21 11 0.064±0.048 0.091±0.064 0.4490.010**21 11 0.063±0.051 0.094±0.058 0.2290.096 N0 N1 27 5 0.079±0.057 0.043±0.023-0.2280.209

METTL3在惡性腫瘤中扮演重要角色。本實驗發現PCa組織中METTL3的mRNA和蛋白水平均明顯高于癌旁良性組織，且METTL3蛋白在前列腺細胞核和細胞質中均有表達。LIN等［17］在肺癌的研究中也發現METTL3表達上調，并在人肺癌細胞的細胞核和胞質裂解液中分別檢測到METTL3蛋白的表達，而其他甲基催化酶則只在細胞核中檢測到表達，這與本實驗結果相符。該研究還運用meRIP?Seq技術發現人肺癌細胞系中癌基因EGFR、TAZ、MAPKAPK2（MK2）和DNMT3A的終止密碼子附近存在一個或多個m6A峰；敲低METTL3后，相關癌基因mRNA的m6A修飾水平下降，其蛋白水平也明顯下降；進一步研究還發現METTL3也可以獨立于其他m6A修飾酶招募翻譯起始因子eIF3來促進目的基因的翻譯。在白血病的研究中也表明，METTL3呈高表達，并促進了c?MYC、BCL2和PTEN癌基因的翻譯，維持急性髓系白血病的增殖［8］。CAI等［20］在乳腺癌中發現上調 METTL3 可使腫瘤相關蛋白HBXIP的mRNA m6A修飾豐度增加，從而使其蛋白表達增加，促進乳腺癌細胞的增殖和生長，沉默METTL3后有效地抑制乳腺癌細胞的增殖和促進凋亡。然而，在宮頸癌和腎癌中METTL3呈低表達，上調其表達可有效抑制腫瘤進展，表現出腫瘤抑制因子的角色［21-22］。由此可見METTL3在不同腫瘤中發揮著促癌或者抑癌的雙重作用，筆者推測METTL3在PCa中發揮促癌的作用，高表達的METTL3可能促進了PCa某些癌基因的翻譯，從而影響PCa的發生和發展。

METTL3催化mRNA的m6A修飾形成，影響著多種生物進程。本實驗發現，PCa中METTL3 mRNA和蛋白的水平與Gleason評分呈正相關，即METTL3 mRNA和蛋白的表達水平與PCa細胞分化呈負相關關系。VU等［23］在急性髓系白血病中得出相似的結論，高表達的METTL3抑制了骨髓造血干細胞的分化，敲低METTL3后急性髓系白血病細胞周期停滯，有效地促進造血干細胞的分化。METTL3催化的mRNA m6A修飾還可以調節精原細胞的分化，促進精子成熟［24］。LI等［25］研究還發現m6A修飾影響了T細胞在體內的平衡和分化，這也暗示m6A修飾可能參與了腫瘤的免疫調節。此外，在胰腺癌的治療研究中發現，敲低METTL3后，癌細胞對化療藥物：吉西他濱、5-氟尿嘧啶、順鉑和放療具有更高的敏感性［26］，這也提示METTL3可能是腫瘤治療的一個新靶點。

PCa的診療中，PSA被作為一項有效的臨床篩查和風險評估的指標。本實驗發現METTL3蛋白的表達水平與PSA值呈正相關關系，結合METTL3與多種腫瘤的相關性，提示METTL3具有與PSA聯合作為PCa診斷標記物的潛能。

綜上所述，本研究通過對TCGA數據集資料分析并運用Western blot、IHC技術，從mRNA、蛋白水平證明METTL3在PCa中呈高表達，其蛋白表達主要定位在前列腺細胞核，胞質少量表達，METTL3表達水平與Gleason評分和PSA值呈正相關。因而我們推測高表達的METTL3可能調控某些癌基因的翻譯，促進PCa的發生、發展，影響PCa細胞的分化，同時可能與PSA聯合作為PCa的診斷標記物。本課題組后續將擴大樣本量研究，繼續探討METTL3在PCa中的表達及臨床意義，并結合分子生物學實驗、細胞實驗進一步闡述其在PCa可能的機制以及與其他m6A修飾酶的相互關系。