EZH2、p53、Ki?67在結直腸腺癌及腺瘤組織中的表達及相關性探討

胡曉舒 常方方 徐小艷 馮智坤 溫一陽 楊金花

1鄭州人民醫院（鄭州 450000）；2河南醫學高等專科學校內科（鄭州 450000）；3河南省人民醫院（鄭州 450000）

結直腸腺癌是常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的健康。近年來我國結直腸腺癌的發病率和病死率有所上升，分別居惡性腫瘤第4位及第5位，且呈逐年增加的趨勢［1］。且大部分患者就診時已處于結直腸腺癌中晚期，5年生存率不足50%，平均生存期也只有38～42個月，臨床生存期較短。因此，如何準確的判斷患者的病情，制定科學合理的治療方案，判斷患者的預后就顯得尤為重要。結直腸腺癌腫瘤標志物的檢測在某種程度上可以滿足這一訴求。

EZH2蛋白作為一種轉錄抑制因子，可明顯抑制腫瘤轉移抑制基因，促進腫瘤細胞的侵襲轉移。p53是最早發現、最重要的抑癌基因，相關研究表明，野生型p53的突變是很多腫瘤發生的原因之一，p53突變與p53蛋白高表達有明顯的相關性。Ki?67是細胞核增殖指數的特異性指標，可以客觀地反映腫瘤細胞的增殖情況。有關EZH2、Ki?67、p53在結直腸腺癌中的單一指標的研究已見相關國內外文獻報道，3個指標聯合研究在結直腸腺瘤及腺癌中的表達及相關性尚未見國內外文獻報道。因此，本研究旨在通過免疫組化法聯合檢測EZH2、p53及Ki?67蛋白在結直腸腺癌、結直腸腺瘤及正常組織中的表達情況，結合患者的臨床病理因素，分析其相關性，以探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料納入標準：（1）經兩名有經驗的病理醫師明確診斷；（2）首發、原發且無其他腫瘤，術前未經任何放化療等輔助治療；（3）臨床病理資料完整；（4）無其他系統嚴重疾病者。收集2015年4月至2017年10月符合上述條件的，鄭州人民醫院普外科手術切除結直腸腺癌組織82例（結直腸腺癌組）、癌旁組織（距癌組織邊緣＞10 cm，即正常組）40例，消化內科腸鏡下切除結直腸腺瘤組織49例（結直腸腺瘤組）。結直腸腺癌組：直腸癌37例，結腸癌45例；男46例，女36例；年齡42～78歲，平均年齡57±10.8歲；腫瘤分化程度高分化27例，中分化43例，低分化12例；有淋巴結轉移39例，無淋巴結轉移43例；浸潤深度T15例，T227例，T325例，T425例；TNM分期Ⅰ期14例，Ⅱ期26例，Ⅲ期37例，Ⅳ期5例。結直腸腺瘤組：男26例，女23例；年齡38～70歲，平均（54±12.3）歲。正常組：男24例，女16例；年齡38～68歲，平均（52±14.1）歲。3組在年齡、性別上差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 試劑與方法所有標本均經4%中性福爾馬林固定，常規脫水、浸蠟、包埋，3 μm連續切片。常規HE染色，觀察結直腸黏膜組織的病理形態。鼠單克隆抗體EZH2購自北京中杉金橋生物技術有限公司，鼠單克隆抗體P53、Ki?67及二抗購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 免疫組化所有組織均經石蠟包埋，每個石蠟塊5 mm連續切片，脫蠟至水；PBS洗3 min，兩次；抑制內源性過氧化物酶，進行必要的抗原修復，PBS洗3 min，兩次；滴加第一抗體室溫2 h或4℃過夜，PBS洗3 min，兩次；滴加第二抗體酶復合物室溫20～30 min，PBS洗3 min，兩次；DAB顯色5～10 min；水洗終止顯色；復染細胞核；分化水洗、返藍水洗、脫水透明、封固。本研究中采用PBS代替一抗作為陰性對照，采用已知陽性片做陽性對照。

1.4 免疫組化結果判斷由病理科醫師進行雙盲法評測。EZH2、p53、Ki?67染色主要位于細胞核，呈棕黃色顆粒為陽性。根據陽性細胞所占比例和陽性細胞胞核著色強度綜合判斷染色結果。低倍鏡下（×40）觀察著色強度：細胞未著色0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；高倍鏡下（×200）觀察陽性細胞所占比例：隨機觀察10個視野，每高倍視野計數100個瘤細胞，取其平均值得出陽性細胞的百分率，陽性細胞數＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。著色強度與陽性細胞數得分乘積＞4即為陽性，≤4即為陰性。

1.5 統計學方法采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。3 組間 EZH2、p53、Ki?67蛋白陽性表達率、結直腸腺癌組臨床病理特征蛋白陽性表達率的比較采用χ2檢驗，EZH2、p53、Ki?67蛋白之間的相關性檢驗用Spearman相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸腺癌、結直腸腺瘤及正常組織中EZH2、p53及Ki?67的陽性表達及比較82例結直腸腺癌組織中EZH2陽性表達66例，陽性率80.49%；p53陽性表達35例，陽性表達率42.68%；Ki?67陽性表達47例，陽性率57.31%。49例結直腸腺瘤組織中EZH2陽性表達20例，陽性率40.82%；p53陽性表達3例，陽性表達率6.12%；Ki?67陽性表達13例，陽性率26.53%。40例正常組織中EZH2陽性表達2例，陽性率5%；p53陽性率1.02%；Ki?67陽性表達1例，陽性率2.5%。結直腸腺癌組EZH2、p53及Ki?67的陽性表達率均明顯高于腺瘤組和正常組，其結果差異具有統計學意義（P＜0.001）。見圖1、表1。

2.2 結直腸腺癌組織中EZH2、p53及Ki?67的表達與臨床病理學特征的關系EZH2、p53及Ki?67的表達與腫瘤的分化程度、浸潤深度、有無淋巴結轉移及TNM分期有關，其差異具有統計學意義。即隨著腫瘤分化程度的降低，浸潤深度加深、淋巴結轉移，3種蛋白的表達明顯升高，TNM臨床分期晚期患者，蛋白的表達也明顯增強。EZH2、p53及Ki?67蛋白的陽性表達與患者的年齡和性別無相關性，差異無統計學意義（P＞0.05）。82例結直腸腺癌組織中EZH2、p53及Ki?67陽性表達患者與其臨床病理特征之間的關系，見表2。

圖1 EZH2、P53、Ki67在結直腸腺癌、腺瘤及正常腸粘膜的表達（IHC×200）Fig.1 The expression of EZH2，P53 and Ki?67 in colorectal adenocarcinoma，adenoma and nomal tissue

2.3 結直腸腺癌組織中EZH2、p53及Ki?67表達的相關性EZH2與p53蛋白共同陽性32例，共同陰性13例，EZH2蛋白陽性而p53蛋白陰性34例，p53蛋白陽性而EZH2蛋白陰性3例，Spearman相關分析呈正相關（P＜ 0.05）。EZH2與Ki?67蛋白共同陽性45例，共同陰性13例，EZH2蛋白陽性而Ki?67蛋白陰性21例，Ki?67蛋白陽性而EZH2蛋白陰性2例，Spearman相關分析呈正相關（P＜0.05）。p53與Ki?67蛋白共同陽性30例，共同陰性30例，p53蛋白陽性而Ki?67蛋白陰性5例，Ki?67蛋白陽性而p53蛋白陰性17例，Spearman相關分析呈正相關（P＜ 0.05）。EZH2、p53及Ki?67蛋白在結直腸腺癌組織中呈現明顯的相關性。見表3。

表1 結直腸腺癌、結直腸腺瘤及正常組織中EZH2、p53及Ki?67的陽性表達及比較Tab.1 The comparison of EZH2,p53 and Ki?67 positive expression in colorectal adenocarcinoma，adenoma and nomal tissue

3 討 論

結直腸腺癌臨床發病率、病死率高，但治愈率卻不高，尤其結直腸腺癌的進展、侵襲和轉移是導致病人死亡的一大原因。結直腸腺癌是多因素作用、多基因參與、多階段調控的疾病，其發病機制尚不太清楚。

EZH2基因是PcG基因家族重要成員，PcG家族可使許多分化相關因子沉默，從而抑制細胞分化［2?3］。EZH2基因可明顯抑制腫瘤轉移抑制基因，促進腫瘤細胞的侵襲轉移殖，使腫瘤細胞失控生長、過度增殖［4?5］。EZH2 基因在多種腫瘤中高表達，正常組織中不表達或少量表達，如血液系統腫瘤、黑色素腫瘤、膽管癌等。研究［6?8］報道，EZH2在轉移性前列腺癌中的表達明顯高于前列腺癌原發灶的表達，且其高表達提示前列腺癌預后不良，EZH2在浸潤性乳腺導管癌中表達高于乳腺原位癌。CHEN等［9］研究也證實了EZH2的高表達可縮短結直腸癌患者的生存時間。本研究表明，EZH2基因在結直腸腺癌中表達水平明顯升高，遠遠高于正常組織，在結直腸腺瘤中中度表達，兩者之間亦有統計學差異。研究還發現，低分化的結直腸腺癌蛋白表達明顯高于中分化、高分化；有淋巴結轉移的蛋白表達率高于無淋巴結轉移組，TNM分期中Ⅲ、Ⅳ期EZH2蛋白的陽性表達率顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期，上述結果差異均具有統計學意義。這與張立成等［10］的研究報道相符。這表明EZH2蛋白的高表達在結直腸腺癌發生發展過程中有著非常重要作用，可用于結直腸腺癌高危人群的篩查，亦可以判斷結直腸腺癌的預后。

表2 結直腸腺癌組織中EZH2、p53及Ki?67的表達與臨床病理學特征的關系Tab.2 The relationship with the expression and the clinical pathologic characteristics of EZH2，P53 and Ki?67 in colorectal adenocarcinoma例

表3 EZH2、p53及Ki?67蛋白在結直腸腺癌中表達的相關性Tab.3 The correlation of EZH2，p53 and Ki?67 expression in colorectal adenocarcinoma例

p53是非常重要的抑癌基因之一，一旦發生突變，可促進細胞惡性轉化，侵襲力增強，使得p53基因由抑癌基因轉變為原癌基因［11?12］。免疫組化方法檢測出來多是突變型p53，野生型p53由于半衰期短、細胞中含量低而難以檢測到［13］。本實驗研究表明，p53在結直腸腺癌中陽性表達率明顯高于結直腸腺瘤和正常組織，進一步對臨床因素的各數據分析顯示，p53蛋白的陽性表達與TNM分期、淋巴結轉移，浸潤深度、分化程度等密切相關，差異有統計學意義。說明p53蛋白的陽性表達率越高，腫瘤的侵襲轉移能力越強。這與卞雪春等［14］研究結果一致。

Ki?67是具有代表性、應用廣泛的細胞增殖抗原之一，其功能與有絲分裂密切相關，在細胞周期各期中，其表達受到精準調控，與腫瘤的增殖和轉移呈正相關［15?16］。本研究中顯示，Ki?67 在不同浸潤深度、不同分化程度的結直腸腺癌組織中的表達有統計學差異，且存在相關性，隨著淋巴結轉移、惡化程度越高、浸入的深入、分期越高，Ki?67的陽性表達越強。這證實，Ki?67亦與腫瘤的發生、發展，惡性細胞的侵襲、轉移密切相關。孫旭凌等［17］臨床研究均也證實了這一結果。

研究證實，野生型p53激活后，可直接通過結合EZH2基因的啟動子抑制該基因的表達。當p53基因發生突變后喪失抑制作用，EZH2 表達則增加［18?19］。筆者的相關性分析結果表明，EZH2與p53表達在結直腸腺癌中呈正相關，這也提示EZH2蛋白在腫瘤中的表達受p53基因的調控。而EZH2、p53及Ki?67三者在結直腸腺癌中陽性表達也呈正相關，且隨著腫瘤分化程度的降低，浸潤深度加深、淋巴結轉移，3種蛋白的表達也明顯升高，推測3種蛋白在結直腸腺癌發展過程可能起協同作用。

綜上所述，聯合檢測EZH2、p53及Ki?67三者在結直腸腺癌中的表達情況，有助于了解腫瘤侵襲轉移等生物學傾向，也可以為腫瘤的靶向及個體化治療提供依據，以期提高治療效果，延長患者的生存期。同時本研究僅用免疫組化得出上述結論尚不充分，因此有必要今后在分子水平上進一步探討。