海鮮菇蛋白質提取條件的優化

◎ 金周雨，丁 淼，康 驍，荊 波，高玉涵，國 微，宋 慧

（1.吉林農業大學生命科學學院，吉林 長春 130118；2.吉林北華大學理學院，吉林 吉林 132013）

海鮮菇隸屬擔子菌門層菌綱傘菌目白蘑科玉蕈屬，又被稱為玉蕈、斑玉蕈、鴻喜菇、真姬菇等，是目前風靡食用菌市場的珍稀菇種之一[1]，在日本享有“聞則松茸，食則玉蕈”的美譽。海鮮菇不僅質地極為爽脆，而且味道也極為鮮美，近年來在日本被廣泛用作食品或調味品[2]。海鮮菇不僅含有對人體有益的黃酮和酚類等營養成分，是一類富含礦質元素的低熱量、低脂肪、高蛋白的大型食用菌[3]，而且還具有抗炎癥、抗氧化、抗腫瘤、提高機體免疫力等功效[4-5]。目前，在人工栽培和活性成分的鑒定是國內外學者對海鮮菇研究的重要方面，而對海鮮菇主要營養成分的利用和深度開發比較欠缺。本實驗選取海鮮菇為實驗材料，通過單因素試驗和正交試驗優化海鮮菇蛋白質的提取條件，為海鮮菇進一步開發和應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

海鮮菇，由吉林農業大學菌物所提供。

1.1.2 試劑及配制

①考馬斯亮藍G-250溶液。考馬斯亮藍G-250粉末0.10 g精確稱取于含有50 mL 95%乙醇的燒杯中，加入100 mL 85%磷酸試劑，充分溶解后加水定容至1000 mL，混勻過濾備用。②標準蛋白質溶液（0.1 mg·mL-1牛血清白蛋白）。精確稱取牛血清蛋白25 mg，加蒸餾水充分溶解后定容至100 mL，吸取定容好的溶液40 mL，用蒸餾水稀釋至100 mL即為標準蛋白質溶液。

以上所用試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設備

主要儀器設備見表1。

表1 實驗儀器表

1.3 實驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制

取出6支試管，然后將試管分別編號為1、2、3、4、5、6，再依次往試管中吸取標準蛋白質溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，加入蒸餾水至1.00 mL，然后加入5.00 mL考馬斯亮藍G-250溶液，振蕩混勻后，室溫條件下反應5 min，于波長595 nm處測定吸光度值，以蛋白質含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.2 樣品提取液的蛋白質含量測定

樣品提取液中蛋白質含量測定應用考馬斯亮藍法。蛋白質提取含量按公式（1）的計算。

式（1）中，W0表示根據標曲計算的蛋白質含量值，單位μg；VT表示提取液總體積，單位mL；W1表示樣品干重，g；VS表示測定時加樣量，mL。

1.3.3 計算海鮮菇蛋白質提取率

通過凱式定氮法(GB 5009.5-2016)[6]測定樣品的總蛋白，按公式（2）計算海鮮菇蛋白質提取率。

式（2）中，MK表示樣品提取的蛋白質質量，單位mg；MZ表示樣品測得的總蛋白質質量，單位mg。

1.3.3.1 海鮮菇蛋白質提取的單因素實驗

（1）單因素實驗中提取溫度的確定。在海鮮菇蛋白質提取時間和提取料液比處理條件不變的條件下，選擇5個提取溫度，篩選不同提取溫度的蛋白質提取率。即當海鮮菇蛋白質提取時間為1.5 h，提取料液比為1∶60，提取溫度分別為70、75、80、85 ℃和90 ℃時，進行海鮮菇蛋白質提取條件篩選。

（2）單因素實驗中提取時間的確定。在海鮮菇蛋白質提取料液比和提取溫度處理條件不變的條件下，選擇5個提取時間點，篩選不同提取時間下的蛋白質提取率。即當海鮮菇蛋白質提取料液比為1∶60，提取溫度為80 ℃，提取時間分別為0.5、1.0、1.5、2.5 h和3.0 h時，進行海鮮菇蛋白質提取條件篩選。

（3）單因素實驗中提取時料液比的確定。在海鮮菇蛋白質提取時間和提取溫度不變的條件下，選擇5個提取料液比不同比例，篩選不同提取料液比的蛋白質提取率。即當海鮮菇蛋白質提取的時間為1.0 h，提取溫度為80 ℃，提取料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60和1∶70時，進行海鮮菇蛋白質提取條件篩選。

1.3.3.2 海鮮菇蛋白質提取的正交試驗

根據單因素實驗結果確定正交試驗的方法，以海鮮菇蛋白質提取率為標準，設計三因素三水平正交試驗表，以進一步對海鮮菇蛋白質的提取條件進行優化，見表2。

表2 正交試驗各因素及水平表

2 結果與分析

2.1 海鮮菇蛋白質提取的標準曲線

以蛋白質含量（μg）作為橫坐標，測得的吸光度（OD）值為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y=0.006 4X+0.011 8，R2=0.997 1，式中Y為吸光度，X為蛋白含量（μg）。線性關系良好。

圖1 海鮮菇蛋白質提取的標準曲線圖

2.2 單因素對海鮮菇蛋白質提取含量的影響

2.2.1 海鮮菇蛋白質提取條件中提取溫度的影響

當海鮮菇蛋白質提取時間為1.5 h，提取料液比1∶60，提取溫度分別為70、75、80、85 ℃和90 ℃，實驗結果見圖2。

圖2 提取溫度對海鮮菇蛋白質提取率的影響圖

由圖2可見，蛋白質提取率伴隨著溫度的升高先升高后降低，當溫度為80 ℃時，蛋白質提取率最高。提取溫度提高可以改進蛋白質的溶解性能，從而提高蛋白質的提取率；另外，在考慮蛋白質提取率的同時，也要兼顧蛋白質的品質，溫度過高，蛋白質會變性失活。基于這樣的分析，蛋白質提取溫度不易定得過高。當海鮮菇蛋白質提取溫度是80 ℃時，蛋白質提取率達到2.135%。

2.2.2 提取時間對海鮮菇蛋白質提取含量的影響

當海鮮菇蛋白質提取料液比為1∶60，提取溫度80 ℃，時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0 h和2.5 h，結果見圖3。

由圖3可見，海鮮菇蛋白質的溶出是當時間達到1.0 h時，蛋白提取率達到最高，而隨著時間延長可能蛋白質降解造成蛋白質含量降低。當海鮮菇蛋白質提取時間為1.0 h時，蛋白提取率達到3.118%。

2.2.3 提取料液比對海鮮菇蛋白質提取含量的影響

當海鮮菇蛋白質提取時間為1.0 h，提取溫度80 ℃，提取料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60和1∶70，結果見圖4。

由圖4可見，海鮮菇蛋白質提取率伴隨著溶液的增多先升高后降低，當料液比為1∶50時，蛋白質提取率最高。隨著物料與溶液的接觸面的增加，易于蛋白質溶出，而當料液比大于1∶50時，蛋白質提取率總體是下降的。當海鮮菇蛋白質提取料液比1∶50時，蛋白提取率達到3.950%。

2.3 正交試驗優化海鮮菇蛋白質提取工藝

在單因素實驗的基礎上，進行正交試驗進一步優化海鮮菇蛋白質熱水浸提條件。正交試驗的結果見表3。

正交試驗的評價指標是蛋白質提取率。根據正交試驗結果，判斷工藝參數的影響大小為提取料液比（B）＞提取溫度（C）＞提取時間（A）。最佳的工藝條件為A2B3C2的條件，即加熱時間為1 h，海鮮菇粉與液體的比例為1∶60，提取溫度為80 ℃，在此條件下海鮮菇蛋白質的提取率最大達到4.670%。

3 結論

①單因素實驗中，當提取溫度80 ℃時，蛋白質提取率最高，達到2.135%。②單因素實驗中，當提取時間為1 h時，蛋白提取率最高，達到3.118%。③單因素實驗中,當提取料液比1∶50時，蛋白提取率最高，達到3.950%。④正交試驗表明，海鮮菇蛋白質提取最佳提條件為提取時間為1 h，料液比為1∶60，提取溫度為80 ℃，在此條件下海鮮菇蛋白質的提取率是4.670%。

4 討論

蛋白質是生物活性物質，在生物體中具有重要作用，是機體營養的主要來源。在動植物及菌類中含有較高的蛋白質成分。劉暢等[7]采用響應面法對北五味子水溶性糖蛋白提取工藝進行優化，發現最佳工藝條件是料液比1∶35（g·mL-1），堿提液pH為9.5，浸提溫度35 ℃，浸提時間3 h時，糖蛋白提取率最高。在本實驗中，對海鮮菇蛋白質的提取以蛋白質提取率為標準，所以在實驗的設計中對溫度、pH的條件設計范圍比較寬。如果對蛋白質活性要求較高，不僅考慮提取溶液的酸堿度，而且提取溫度不宜過高，否則可能會破壞蛋白質的二級結構，使其生物活性降低甚至破壞。