不同質量濃度鰱魚肌球蛋白低溫自組裝動力學及理化性質

高 霞，曹立偉，熊善柏,2，胡 楊,2，尤 娟,2，劉 茹,2,*

（1.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.國家大宗淡水魚加工技術研發分中心（武漢），湖北 武漢 430070）

肌球蛋白是肌纖維蛋白的重要組成部分，也是魚糜形成凝膠最重要的功能性蛋白[1-2]，肌球蛋白在體外很不穩定，會迅速組裝成微絲，呈現出高度有序的組裝特性[3]。組裝體的尺寸和形態受自組裝條件的影響，比如蛋白濃度、溫度[4-5]、pH值、鹽濃度[6]、鹽的種類[7]和溶劑類型等[8]。因此，可通過控制自組裝條件來制備不同的肌球蛋白組裝體，進而設計成不同性能的產品。肌球蛋白大分子的自組裝需要一定的濃度，濃度較低時，自組裝不能進行[9]。隨蛋白濃度增加，蛋白分子的疏水性區域相互接觸，促使蛋白分子間相互作用[10]，大分子自組裝，進而絮凝、成膠甚至形成緊密的網絡結構[11]。且隨蛋白濃度增加，蛋白凝膠的強度會提高[12-13]。此外，Adam等[14]研究了幾種不同濃度的大分子溶液（極稀溶液、稀溶液、高濃度溶液），證明這些大分子間的交聯依次呈現遞增的趨勢。魚糜加工過程中，低溫下初加工需較長的時間，低溫下肌球蛋白低聚物會自組裝成簇，影響魚糜的凝膠特性[15-16]，二段式加熱有利于魚糜形成高彈性和持水性的凝膠體[17]。目前大多數研究集中于較高溫度下肌球蛋白分子的組裝和成膠[18-19]，對低溫下肌球蛋白自組裝的濃度效應鮮見報道。研究肌球蛋白低溫自組裝動力學及理化性能，不僅能為提高自組裝能力提供新的切入點，還可為減少肌球蛋白在熱膠凝前不期望的自組裝，提高其熱凝膠性能提供參考。

本實驗以鰱魚肉為原料提取肌球蛋白，采用激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）觀察肌球蛋白組裝體的微觀結構，通過研究不同質量濃度肌球蛋白在低溫自組裝過程中蛋白質構象和分子間作用，以及組裝體的濁度和粒徑的變化，來探討低溫下肌球蛋白在不同質量濃度下自組裝的特點，獲得不同質量濃度肌球蛋白低溫自組裝動力學方程，并對組裝體的流變學性能進行分析，以期為拓寬魚蛋白的應用領域、提高魚蛋白的膠凝特性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱（Hypophthalmichthyx molitrix），個體質量約為1.5 kg，購自華中農大菜市場，將活鰱魚迅速運回實驗室，宰殺取背脊部肉，暫時不用的置于4 ℃冰箱里保存，所用實驗原料均是當天的新鮮魚肉。

牛血清白蛋白（分析純） 武漢科瑞生物技術有限公司；羅丹明B染料（分析純） 美國Sigma-Aldrich公司；β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）（純度≥99.0%）、疊氮鈉（NaN3）（高級純） 美國Amresco公司；其他均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

1750型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；722 N型可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；ZEN 3600激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；AR 2000 ex流變儀 英國TA公司；LSM 510 META CLSM德國Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

參考Cao Liwei等[20]的方法提取肌球蛋白，尸僵前的鰱魚背脊肉用食品調理機絞碎，向絞碎后的魚肉中加入10 倍體積含0.1 mol/L KCl、0.2 mg/mL NaN3和20 mmol/L Tris-HCl的緩沖液（pH 7.5），并用高速分散均質機于9 000 r/min下均質1～2 min。均質液于4 ℃下放置15 min，8 000 r/min離心5 min后去除上清液，將沉淀于5 倍體積0.45 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 6.8，含5 mmol/L β-ME、0.2 mol/L Mg2CO3、1 mmol/L乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸）中懸浮，同時加入ATP-Na2使肌球蛋白與肌動蛋白解離，ATPNa2的終濃度控制為5 mmol/L。于4 ℃下放置60 min后10 000 r/min 離心10 min，上清液用6 倍體積1 mmol/L KHCO3稀釋，于4 ℃下放置60 min，然后12 000 r/min 離心10 min。沉淀重新用2.5 倍體積的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5，含0.5 mol/L KCl、5 mmol/L β-ME）懸浮，于4 ℃下放置15 min，再用2.5 倍體積的1 mmol/L KHCO3稀釋，并加MgCl2固體粉末至終濃度為10 mmol/L，于4 ℃下放置過夜，然后12 000 r/min離心15 min收集沉淀，得到純化的肌球蛋白。肌球蛋白質量濃度測定參考Lowry法[21]，用牛血清白蛋白作標曲。純度采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）來檢驗。

1.3.2 樣品處理與制備

用0.5 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0）將肌球蛋白的質量濃度分別調整至0.1、0.3、0.5、1.0、5.0 mg/mL和8.0 mg/mL，分別于4 ℃下靜置2、12、24、36 h，取樣，測定相應的理化指標，其中，5.0 mg/mL和8.0 mg/mL樣品僅用于靜態流變學測定和CLSM觀察。

1.3.3 紫外吸收光譜測定

以0.5 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0）為參比空白，采用紫外-可見分光光度計在230～350 nm波長范圍內進行中速掃描，采樣間隔1 nm。利用Origin 8.0軟件作圖。

1.3.4 濁度測定

濁度的測定參考Yongsawatdigul等[22]的方法，以溶液320 nm波長處的吸光度（A320nm）來表示蛋白質溶液的濁度。

1.3.5 動態光散射表征粒徑大小

參考Zhan Fuchao等[23]的方法，采用激光粒度儀測定樣品的平均粒徑及粒徑分布。水溶劑黏度0.8873 mPa·s、介質折射率1.33、物質折射率1.45，相關測量時間函數通過自動程序分析，平均粒徑由電腦自動輸出。吸取2 mL樣液置于“聚苯乙烯”樣品池中，放入儀器中于25 ℃下進行測試（散射角度173°）。每個樣品測試3 次，每次測試激光掃描15 圈。

采用一階模型[24]（式（1））對組裝體的平均粒徑數據進行擬合。

式中：Z表示t時刻的平均粒徑/nm；Z0表示初始平均粒徑/nm；k表示組裝速率/h－1；t表示組裝時間/h。

1.3.6 靜態流變學性能測定

采用動態流變儀在flow模式下掃描，測試條件為：溫度4 ℃、錐板（2°）直徑40 mm、載物臺與平板間距54 μm。數據獲取模式為Continuous step，以剪切速率（γ）為變量，變量范圍為0.1～1000 s－1，得到剪切應力（τ）隨剪切速率變化曲線，采用冪律定律（式（2））擬合τ-γ曲線。

式中：τ表示剪切應力/Pa；K表示稠度系數/（Pa·sn）；γ表示剪切速率/s－1；n表示流動指數。

表觀黏度（ηa/（Pa·s））可由式（3）計算獲得。

采用Cross模型（式（4））擬合其零剪切黏度（η0）。

式中：η∞表示無窮剪切黏度/（Pa·s）；η0表示零剪切黏度/（Pa·s）；α表示Cross模型參數。

1.3.7 CLSM分析

采用CLSM觀察肌球蛋白組裝體（組裝12 h）的立體顯微結構及在溶液中的分布狀況。使用羅丹明B對蛋白質進行標記，磁力攪拌后得到均勻樣品，待測。標記量為每50 mL樣液加入體積分數0.2%羅丹明B 100 μL。取適量的樣品于顯微鏡長蓋玻片上，使用10×目鏡和100×物鏡觀測，選用熒光模式。采用He/Ne激光器作為激發光源，發射波長確定為543 nm，使用光電倍增管進行熒光檢測。掃描密度為1 024×1 024，掃描頻率為40 Hz。參數確定后進行掃描，采集液滴圖像。儀器平均多次掃描信號的波動，以減少對激光共聚焦圖片的影響。實驗在25 ℃空調房間內避光測量。用儀器自帶的LSM Image Examiner軟件對圖像進行分析和數據處理。

1.4 數據處理

所有數據均采用Origin 8.0軟件作圖，SAS 8.0統計軟件進行分析，用ANOVA進行方差分析，顯著性檢驗方法為最小顯著性差異（least significant difference，LSD）法，P＜0.05表示差異顯著。有關數據為3 次以上平均值。

2 結果與分析

2.1 鰱魚肌球蛋白純度鑒定

圖1 提取的肌球蛋白的SDS-PAGE譜圖（a）和各條帶所占比例（b）Fig.1 SDS-PAGE patterns of the extracted myosin （a） and the percentage of each band in SDS-PAGE pattern （b）

提取的鰱肌球蛋白的SDS-PAGE圖見圖1a，肌球蛋白重鏈的分子質量為223 kDa，肌球蛋白輕鏈的分子質量為21、14 kDa，這與之前學者報道的肌球蛋白分子由2 條分子質量各為220 kDa的重鏈和4 條分子質量在17～22 kDa范圍的輕鏈所組成[25]是基本一致的。圖1a中幾乎看不出肌動蛋白的條帶（43 kDa），在70 kDa處有含量甚微的原肌球蛋白帶。肌球蛋白具有物種差異性，且不同魚種之間也有差別，尤其體現在輕鏈上。通過Gel-pro analyzer 4.0凝膠定量分析軟件計算得出各條帶的比例分布。由圖1b可知，肌球蛋白重鏈在整個泳道所有條帶中所占比例達75%，同時也計算得出肌球蛋白的純度達92%，說明所得肌球蛋白的純度高，可作為本實驗原料使用。

2.2 不同質量濃度肌球蛋白低溫放置過程中的紫外吸收光譜

圖2 不同質量濃度肌球蛋白溶液低溫放置過程中的紫外吸收光譜Fig.2 UV absorption spectra of myosin assembly suspension under the condition with different concentrations

紫外吸收光譜是一種研究蛋白構象的有效手段[26]。由圖2可以看出，肌球蛋白溶液在276 nm波長處有明顯的吸收峰，表明有色氨酸、酪氨酸等疏水性氨基酸殘基的存在[27]，隨著放置時間的延長，該吸光度呈增大趨勢，說明肌球蛋白分子鏈逐漸伸展，暴露出更多的疏水性殘基。320～350 nm波長范圍內吸光度也隨放置時間的延長而增大，結合276 nm處吸光度的變化，推測放置過程中肌球蛋白分子伸展暴露出更多的活性基團，有利于分子間相互作用，形成了大的組裝體，增加了光散射強度。Brenner等[15]曾報道了類似的現象，鱈魚肌球蛋白在低溫條件下也會自發組裝形成寡聚體。隨著蛋白質量濃度的增加，吸光度呈增加趨勢，且隨著放置時間的延長，質量濃度高的肌球蛋白樣品吸光度增大的幅度更大。

2.3 不同質量濃度肌球蛋白低溫放置過程中的濁度變化

圖3 不同質量濃度下肌球蛋白低溫放置過程中的濁度變化Fig.3 Turbidity of myosin suspension at different concentrations

濁度可用于反映蛋白質的組裝情況。由圖3可知，0.1、0.3 mg/mL的肌球蛋白樣品在放置的前24 h，其濁度隨放置時間的延長顯著增大，24 h后濁度緩慢增大但無顯著變化。濁度增大可能是由于肌球蛋白自組裝形成了大的組裝體[2,28]，有研究報道，低溫下肌球蛋白分子間主要依靠氫鍵、靜電相互作用等組裝形成微粗絲[6]。隨后肌球蛋白以微粗絲為“成核中心”，繼續組裝形成更大尺寸的粗絲，濁度進一步增大，24 h以后肌球蛋白的自組裝基本達到了動態平衡。0.5、1.0 mg/mL肌球蛋白樣品的濁度隨著放置時間（0～36 h）的延長而顯著增大（P＜0.05），說明在放置時間（36 h）內肌球蛋白自組裝持續進行。肌球蛋白的自組裝行為是一個有序排列的過程，質量濃度越大，混亂度也越大，達到有序結構的時間也相對越長。

2.4 不同質量濃度肌球蛋白低溫放置過程中的粒徑變化

為進一步了解肌球蛋白組裝體的尺寸大小和穩定性，采用動態光散射技術測定了肌球蛋白在組裝過程中的粒徑分布及平均粒徑，結果見圖4。由圖4a可知，隨著放置時間的延長（2～36 h）和蛋白質量濃度的增加（0.1～1.0 mg/mL），肌球蛋白組裝體的粒徑分布均向大粒徑方向移動，說明自組裝在進行，且肌球蛋白質量濃度越大，形成的組裝體越大。由圖4b可知，0.1 mg/mL的肌球蛋白組裝體的平均粒徑在2～12 h之間隨放置時間延長顯著增大（P＜0.05），繼續延長自組裝時間（12～36 h）對平均粒徑的影響不顯著（P＞0.05），說明低質量濃度肌球蛋白自組裝能較快達到平衡。0.3 mg/mL的肌球蛋白組裝體的平均粒徑在2～12 h之間顯著增大（P＜0.05），但在12～24 h間增長不顯著（P＞0.05），繼續延長自組裝時間（24～36 h），平均粒徑又顯著增大。0.5、1.0 mg/mL的肌球蛋白組裝體的平均粒徑隨著自組裝時間（2～36 h）的延長一直呈顯著上升趨勢（P＜0.05），說明提高蛋白質量濃度后自組裝平衡所需的時間也隨之延長，各質量濃度下肌球蛋白樣品的自組裝可劃分為成核、組裝、平衡3個階段。該結果與濁度結果基本一致。

圖1 不同質量濃度下肌球蛋白組裝體的粒徑分布（a）及平均粒徑（b）Fig.1 Particle sizes （a） and Z-average particle sizes （b） of myosin assemblies at different concentrations

為進一步探究肌球蛋白組裝動力學，采用一階模型對其平均粒徑進行擬合，方程P值均小于0.05，說明該模型具有較高的擬合精度，所得動力學參數見表1。隨著蛋白質量濃度增大（0.1～1.0 mg/mL），肌球蛋白樣品的初始平均粒徑（Z0）呈上升趨勢，即質量濃度越高，初始組裝體越大。肌球蛋白質量濃度較低（0.1～0.3 mg/mL）時，組裝速率k值較接近，當肌球蛋白質量濃度由0.3 mg/mL增至1.0 mg/mL時，組裝速率迅速增大，說明肌球蛋白在低質量濃度時組裝速率慢；當質量濃度提高至0.5 mg/mL以上時，肌球蛋白之間相互接觸的幾率更大，暴露出的活性基團更易發生相互作用，組裝速率加快，分子以微粗絲為成核中心，繼續組裝成為更大的組裝體。

表1 低溫下肌球蛋白自組裝的動力學參數Table1 Kinetic parameters for myosin self-assembly at low temperature

根據表1中得到的參數，進一步對組裝速率k與質量濃度ρ進行擬合，可用線性方程很好地描述兩者之間的關系。因此，將質量濃度作為動力學方程的自變量之一，重新擬合得到的方程為：（P＜0.000 1），說明該方程可以很好地描述不同質量濃度肌球蛋白在低溫自組裝過程中粒徑隨時間的變化。且通過該方程可更直觀地看出，速率常數隨著蛋白質量濃度的增加而增大，表明質量濃度較高時組裝體粒徑增大的速度加快。

2.5 不同質量濃度肌球蛋白在低溫放置過程中流變學特性

圖5為自組裝12 h肌球蛋白樣品的剪切應力τ隨剪切速率γ的變化（其他放置時間下趨勢類似，故省略）。溶液的剪切應力隨著剪切速率的增加而增大，在低剪切速率下，剪切應力隨剪切速率的增長呈近似直線增長的趨勢，表現出牛頓流體的性能，此階段流體的黏性表征為零剪切黏度（η0），不受剪切速率的影響。利用Cross模型擬合所得η0見表2，對于低質量濃度（0.1～0.3 mg/mL）的肌球蛋白樣品而言，延長放置時間，η0很小且沒有明顯變化，說明低質量濃度時肌球蛋白相對穩定，分子間相互作用較弱，流動性強。對于質量濃度為0.5～8.0 mg/mL的肌球蛋白，隨著自組裝時間從2 h延長至24 h，η0逐漸增大，表明肌球蛋白分子間相互作用增強，形成了具有一定結構的組裝體，流動性下降。該實驗結果表明肌球蛋白自組裝需要一定的質量濃度（不低于0.5 mg/mL），達到該質量濃度分子鏈間相互交聯和纏結形成組裝體。

圖5 自組裝12 h下肌球蛋白溶液的τ-γ曲線Fig.5 τ-γ curves of silver carp myosin at the self-assembly time of12 h

表2 不同自組裝時間下肌球蛋白溶液的η0Table2 Parameter η0of myosin suspension at different self-assembly time Pa·s

在22～220 s－1剪切速率范圍內，肌球蛋白組裝體部分解體，分子鏈段隨流動方向拉伸、取向，剪切應力與剪切速率不能維持正比關系，偏離直線變成向下彎曲的曲線（圖5），表現出剪切稀化行為，采用冪律定律進行擬合，結果見表3。所得模型P值均小于0.01，說明具有較高的擬合精度，所有肌球蛋白溶液的n值均小于1，表現為假塑性流體。隨著自組裝時間（2～36 h）的延長，質量濃度為0.5～8.0 mg/mL的肌球蛋白所形成的組裝體的n值逐漸降低，K值逐漸增大；同樣，隨著蛋白質量濃度增加，n值也下降，說明溶液的假塑性增強，推測這是由于肌球蛋白分子間發生了相互作用，導致所形成組裝體的尺寸逐漸增大而流動性降低。這與本實驗室前期研究魚肉與豬肉肌動球蛋白靜態流變學性能的結果一致，肌動球蛋白質量濃度增大也會使其假塑性增強，降低其流動性[29]。

表3 不同自組裝時間下肌球蛋白溶液的稠度系數（K）和流動指數（n）Table3 Consistency coef fi cients （K） and fl ow indices （n） for myosin suspension at different self-assembly time

圖6 不同組裝時間下肌球蛋白表觀黏度（ηa）與剪切速率（γ）的關系Fig.6 Relationship between apparent viscosity （ηa） of myosin and shear rate （γ） at different self-assembly time

由圖6可知，所有樣品的ηa都隨著γ增大先迅速下降后緩慢下降至趨于穩定，這種趨勢在較高質量濃度（1.0～8.0 mg/mL）下更直觀，推測較高質量濃度下形成的肌球蛋白組裝體具有相互纏繞和交聯的長分子鏈結構，在靜止時將保持其內部結構的有序性，因而具有較高的內部阻力阻礙流動，表現為較高的黏度；低剪切速率下，盡管有輕微的剪切取向效應，但分子的無規則布朗運動使所有的分子或分子組裝體都處于無序狀態。隨著γ的增大，肌球蛋白溶液將沿著剪切驅動力的方向流動，部分組裝體解體，分子鏈逐漸解纏繞、拉伸和取向，排列后的分子或分子組裝體更容易相互滑移，溶液的ηa急劇下降[30]。當γ增大到一定程度，ηa趨于穩定，即表現出類似牛頓流體的性能。

2.6 不同質量濃度肌球蛋白低溫放置過程中的微觀結構

圖7 肌球蛋白組裝體的CLSM圖（×1 000）Fig.7 CLSM images of myosin assemblies （ × 1 000）

圖7 為低溫下肌球蛋白溶液組裝12 h后的CLSM圖。組裝體的尺寸隨蛋白質量濃度增加而增大；當質量濃度為0.1、0.3 mg/mL時，溶液中可以觀察到極少量肌球蛋白的存在；質量濃度為0.5 mg/mL的肌球蛋白經過自組裝后形成了均一分散在溶液中的小聚集體（粒徑＜20 μm）。這是由于低質量濃度下肌球蛋白分子間的距離較大，分子間自組裝行為不易進行且組裝速率較低；隨著蛋白質量濃度增大（大于等于0.5 mg/mL時），肌球蛋白自組裝速率提高，甚至組裝成肉眼可見的粗絲（5.0、8.0 mg/mL）。綜上分析可知，肌球蛋白低溫快速自組裝的臨界質量濃度為0.5 mg/mL，這與膠原蛋白自組裝的臨界質量濃度在0.30～0.45 mg/mL之間相近[31]。

3 結 論

低溫（4 ℃）放置過程中肌球蛋白的自組裝行為表現出較強的質量濃度依賴性。隨自組裝時間的延長和蛋白質量濃度增大，分子間相互作用加強，初步聚集成微絲并繼續以其為成核中心組裝成更大的組裝體，使得肌球蛋白溶液在230～350 nm波長范圍內的吸光度和濁度增大；動態光散射所測組裝體粒徑的變化可由動力學模型

較好地描述，當質量濃度提高到0.5 mg/mL時，肌球蛋白溶液的組裝速率加快；隨著肌球蛋白質量濃度進一步增大，組裝平衡時間也延長。進一步用靜態流變學表征樣品的性能變化發現，各質量濃度肌球蛋白溶液都呈現出典型的剪切稀化行為，隨蛋白質量濃度提高，肌球蛋白組裝體對溶液流動的阻礙作用增強，表觀黏度隨剪切速率增大而降低；CLSM觀察發現，0.5 mg/mL時溶液所形成的組裝體尺寸較小且分布均勻，再提高質量濃度便能形成肉眼可見的粗絲。綜上結果推測肌球蛋白快速自組裝的臨界質量濃度是0.5 mg/mL。