食品中生物胺含量及生物胺氧化酶的研究進展

李彬彬，徐 曄，牛淑慧，張 楠，李 瑋，宋桂森，張若瑤，楊 勇*

（四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

生物胺（biogenic amines，BA）是一類廣泛存在于食品尤其是發酵食品中的具有潛在毒性的生物活性物質，發酵食品中BA主要是在微生物的作用下通過氨基酸脫羧生成。適量的BA對人體具有一定生物活性[1]，但攝入過量的外源BA則會危害人體健康[2-7]。體外實驗研究表明一些從手工乳酪和葡萄酒中分離的腸球菌和乳桿菌能夠在類似人體腸道環境中產生酪胺和腐胺，同時其產生的酪胺、腐胺可增強菌株在該環境中的存活能力[8-9]。此外，de Fernández等[8]研究發現堅忍腸球菌產生的酪胺導致對Caco-2人體上皮細胞的高附著力和免疫調節作用。以上研究結果表明食品中產生BA的菌株能夠在腸道內環境中存活并產生BA。因此減少食品尤其是發酵食品的BA含量，控制產BA菌株的生長就顯得尤為重要。

面對發酵食品生產加工過程中高BA含量的問題，常采取的措施主要有：1）降低前體物氨基酸水平[10]；2）抑制腐敗微生物的生長[11]；3）使用不產氨基酸脫羧酶的發酵劑[12-14]。當這些方法都無法有效降低BA含量時，可采用添加微生物或BA降解酶的方法[15-16]。國內外許多學者通過接種不具有產氨基酸脫羧酶活性而具有BA氧化酶（amine oxidases，AOs）活性的微生物來降解食品中的BA[11,17-18]，取得了良好的效果，其中起關鍵作用的就是AOs。

AOs是BA代謝中的關鍵酶，其分離純化和降解特性一直是近年來國內外BA降解研究的熱點。更有學者將AOs加入到發酵食品中，探究其在食品內環境中對BA的降解情況，發現AOs能顯著降低BA含量，且效果優于添加微生物，因而應用AOs解決食品中高BA含量問題具有良好的前景。

1 食品中BA的含量

魚及魚制品、發酵香腸、乳酪、酒類以及醬油等食品中的微生物是其品質形成的重要因素，該類食品在蛋白酶的作用下含有豐富的游離氨基酸，但當存在具有氨基酸脫羧酶活性的微生物時，容易形成BA。目前國際上對食品中BA含量并無統一的標準，并且對BA的限量主要集中在水產品和葡萄酒中，涉及的BA主要為組胺和酪胺（表1）。

表1 不同國家及地區對BA的限量標準Table1 Maximum limits for biogenic amines in different countries

1.1 魚制品

魚制品營養豐富，具有大量高品質的蛋白質，因而容易受到微生物的污染，生成大量的BA。在魚制品中，組胺、酪胺、腐胺、尸胺、精胺和亞精胺是主要的BA，通常通過檢測組胺、尸胺、腐胺的含量來判斷魚產品是否變質[24]。因此，通過監測BA水平來評估產品的新鮮程度就顯得尤為重要。在水產品中，組胺是最常被檢測的BA，在許多國家均有限量標準，Bilgin等[25]分別檢測了沙丁魚罐頭、鯖魚罐頭、金槍魚罐頭和腌鳳尾魚樣品中5 種BA的含量，發現組胺和尸胺是最主要的BA。研究發現沙丁魚、鯖魚、鳀魚等為高組胺魚類，魚制品的貯藏溫度對高組胺魚類中組胺的形成有重要的影響，當在22 ℃貯藏12 h后，沙丁魚和鯖魚中組胺含量達到50 mg/kg，而鳀魚在35 ℃貯藏8 h后，組胺含量甚至可達到254 mg/kg[26-27]。

1.2 發酵香腸

關于肉制品中BA含量并沒有統一的限量標準，為了保證產品的質量及安全性，有學者建議將肉制品中組胺和酪胺限量值均設為100 mg/kg[28]。研究發現在歐式發酵香腸中酪胺是主要的BA，其次是腐胺和尸胺，酪胺、腐胺和尸胺的最高含量可達773.43、648.85、620.96 mg/kg[29]。在傳統中式香腸中，組胺和酪胺是主要的BA，且含量均超過100 mg/kg，此外腐胺、尸胺等其他BA均有檢出[30]。Papavergou等[31]檢測的50 個希臘發酵干香腸中，除精胺和亞精胺外，其余的BA含量有較大變化，其中酪胺、腐胺、組胺和尸胺的含量范圍分別為0～510、0～505、0～515 mg/kg和0～690 mg/kg。由此可見，組胺、酪胺、腐胺、尸胺是發酵香腸中主要的BA。精胺和亞精胺主要來源于原料肉，且在加工過程中含量變化不顯著。

1.3 乳酪

由于蛋白質水解是乳酪品質形成的最主要的過程，因此乳酪很容易形成BA。總的來說，乳酪中BA的含量和類型不僅取決于原料乳及其加工處理過程和其所采用的發酵劑，還與乳酪成熟的條件、成熟后的處理方式、包裝類型、貯藏溫度和時間有關，并且乳酪不同部位BA的含量和類型也有很大差異[32-33]。Schirone等[34]發現直接經原料乳發酵制成的乳酪總BA含量可高達5 860.6 mg/kg，經巴氏殺菌的原料乳制成的乳酪中BA含量相對較低，為10.3～582.4 mg/kg，表明原料乳的衛生質量和加工前處理對BA含量有著重要的影響。此外，研究表明成熟時間較短的乳酪BA含量低于成熟時間較長的乳酪，因為隨著時間的延長乳酪中蛋白質水解水平和氨基酸代謝水平也在逐步增加[35]。Guarcello等[36]對20 個乳酪樣品中BA含量檢測發現，組胺、酪胺、腐胺、尸胺含量差別很大，有的甚至可達900 mg/kg，50%樣品中至少有一種BA的含量處于潛在毒性含量范圍（超過100 mg/kg）。

1.4 酒類

研究證實當乙醇體積分數低于10%時可增加氨基酸脫羧酶活性[37]，乙醇體積分數12%時能抑制胺氧化酶活性[38-39]，一定體積分數的乙醇能促進BA的生成、抑制BA的降解。因此，與其他食品相比，酒類食品中的BA含量有更為嚴格的限量要求。許多國家均對葡萄酒中BA質量濃度制定了嚴格的限量標準，其中德國規定最嚴格，為不超過2 mg/L[38]。葡萄酒中BA的形成和乳酸菌有關，當內源乳酸菌達到充足水平時，葡萄酒的蘋果酸-乳酸發酵就會自發開始。在蘋果酸-乳酸發酵過程中，乳酸菌主要通過麥芽酸酯酶將L-馬來酸轉化為L-乳酸，該酸是一種中酸性物質，能增強細胞的活性，從而提高微生物的穩定性[40]。因此，蘋果酸-乳酸發酵被認為是紅酒生產的一個關鍵階段，但也正是在這個發酵過程中產生了大量的BA[41]，當酒的發酵條件有利于BA形成時，自發的蘋果酸-乳酸發酵就會導致BA的大量累積。有研究報道在這個過程中BA質量濃度接近30 mg/L[42]。葡萄酒中BA含量與葡萄和葡萄汁的氨基酸含量、年份、SO2濃度、酸度、釀造條件、酒糟含量以及細菌氨基酸脫羧酶活性等有關[42-48]。葡萄酒中BA的含量也與葡萄酒的類型有關，一般認為紅葡萄酒中BA含量比白葡萄酒高。Kántor等[49]對25 種斯洛伐克葡萄酒中8 種BA質量濃度進行測定后發現，在所有樣品中，苯乙胺、尸胺、組胺、亞精胺均沒有檢出，酪胺、腐胺、精胺均有檢出，但腐胺和精胺的質量濃度很低，色胺質量濃度最高（（170.9±5.3）mg/L）。除葡萄酒外，對白酒和黃酒中的BA也有相關研究報道。研究發現酪胺和腐胺是黃酒中主要的BA[50]。Zhong Jianjun等[51]測定39 個不同廠家的黃酒樣品，其中5-羥色胺、腐胺、酪胺、尸胺、組胺為主要的BA，它們的平均質量濃度分別為53.3、24.3、19.2、9.08、8.83 mg/L，BA總質量濃度平均為115 mg/L。范文來等[52]研究發現白酒中BA質量濃度與其他酒類食品相比是最低的，這可能與BA在蒸餾過程中大部分被蒸餾出來有關，從而使其未進入酒中。因此，加強對酒類食品中BA質量濃度的監控，降低BA含量，是提高酒類食品安全性的關鍵，也是保障我國酒類食品打入國際市場的關鍵。

1.5 醬油

醬油是我國傳統的發酵食品，是人們生活中必不可少的調味品。發酵過程中，其在微生物和蛋白酶的作用下產生大量的氨基酸，進而容易產生BA，威脅醬油的安全性。Lu Yongmei等[53]檢測了40 種不同廠家的醬油，發現酪胺是最主要的BA，BA總質量濃度高達1 357 mg/L。該研究還發現醬油中BA質量濃度與氨基酸態氮水平呈明顯的正相關性。不同樣品的BA種類和含量雖存在差異，但大多數研究表明酪胺、腐胺、苯乙胺是質量濃度較高的BA[54-55]。

2 AOs的分類及其影響因素

目前，常通過控制前體物水平、BA產生菌株的生長、氨基酸脫羧酶活性以及增強AOs活性來降低發酵食品中的BA含量。由于采用控制腐敗微生物生長的方法來降低食品中BA含量存在一定的局限性，不能有效減少已生成的高含量BA，僅僅依靠提高原材料衛生質量、降低微生物污染水平不足以完全或有效避免BA的形成，還須要結合其他措施來減少食品中BA的形成，提高BA的降解。其中AOs是研究BA降解的關鍵酶。

2.1 AOs的分類

AOs是由BA降解菌株合成的，能夠將已生成的BA分解成相應的醛、氨氣和過氧化氫的一類酶[56-57]，廣泛存在于動植物和微生物體內。在動植物體內，其可通過調節細胞內胺的含量及生成產物的濃度來參與生物機體的生成發育過程，并對各種逆境脅迫作出相應的適應性調整[58-59]；在微生物體內其可通過誘導產生，在食品中以具有AOs活性的微生物為發酵劑能有效降低BA含量。到目前為止，發現的AOs已有含核黃素的單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）（EC.1.4.3.4）、腐胺氧化酶（EC.1.4.3.10）、含銅的初級胺氧化酶（EC.1.4.3.21）和含銅的二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）（EC.1.4.3.10）。

AOs分為MAO、DAO和多胺氧化酶（polyamine oxidase，PAO）。MAO多屬于含銅氧化酶[60]，由于最先發現的MAO以酪胺為底物，又叫酪胺氧化酶。MAO在動物體內分布廣泛，在代謝BA方面起著主要的作用，在原核生物如腸桿菌屬、銅綠假單胞菌等中也有發現[61]。微生物中的AOs在自發的生物活性或BA分解過程中具有重要的作用。有研究從黑曲霉中分離純化出MAO[62]。通過測壓法和輻射測定法發現該酶是膜結合的酶，并且和芳基硫酸酯酶的合成有關[63-64]。

DAO主要作用于組胺和腐胺，用來調節其在組織中的水平，屬于含銅的AOs。DAO的來源主要有豬肝臟、腎臟、人類胎盤、血漿，以及綠膿桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌等微生物。腐胺在DAO的作用下可轉化成氨基丁醛，進而氧化成吡咯啉[65]。

PAO是指所有能氧化多胺類物質的酶，是催化多胺氧化降解的關鍵性酶。既有含黃素腺嘌呤二核苷酸（f l avine adenine dinucleotide，FAD）的PAO，又有含銅的PAO，含銅的PAO作用于一級氨基，而含FAD的PAO除作用于一級氨基外，還可作用于二級和三級氨基[66]。

2.2 AOs活性的影響因素

AOs活性受底物、BA、抗組胺藥物和食源性抑制劑的影響，如乙醇、肌肽、硫胺素、酪胺、尸胺等均能降低其活性[67]。AOs對BA的降解沒有嚴格的特異性，一種AO至少能降解一種BA，其底物特異性和作用位點存在相關性差異。Leuschner等[68]研究了發酵食品中的微生物對組胺和酪胺的降解能力，發現27 株乳酸菌、21 株擴展短桿菌和似棒狀桿菌均能降解組胺和酪胺，這些微生物的酶活力呈現不同的定量水平。有研究認為BA本身也有抑制AOs活性的作用，如酪胺能夠抑制MAO的活性，色胺能夠抑制DAO的活性[18]。

除此之外，食品的加工貯藏條件在很大程度上影響著AOs活性。有研究表明，DAO在中性和堿性環境下其酶活性最大，并且氧氣在該酶反應中是不可缺少的。異變微球菌LTH 1540菌株對酪胺的降解嚴格地受pH值（最適pH值為7.0）、溫度、NaCl濃度以及葡萄糖和肼屈嗪濃度的限制，且在有氧條件下該酶的活性較高[68]。微生物AOs降解BA的能力依賴于環境條件，在適宜條件下，發酵香腸中木糖葡萄球菌S81在體外可完全降解組胺和部分酪胺，但是由于體內低氧氣體積分數、低pH值和高鹽濃度等惡劣的環境條件，這些微生物的AOs活力不能在體內定量重現[69-70]。

由此可見，食品的環境條件，尤其是加工貯藏溫度、pH值、鹽濃度是影響AOs活性的重要因素。在發酵食品中，加工貯藏的溫度、pH值、鹽濃度和氧氣體積分數等在控制食品中微生物數量、防止腐敗微生物污染的同時，也影響著AOs活性，不利于其發揮作用。因此，在將AOs應用于食品中控制BA含量時，必須充分考慮食品的環境條件對AOs活性的影響，在不影響食品品質的前提下，可以最大限度地創造有利于AOs發揮降解作用的環境條件，保證食品的質量安全。

3 AOs產生菌株

食品中的BA是食物組成和微生物群體酶活性之間復雜作用的結果，因此篩選不產氨基酸脫羧酶且具有較高AOs活性的菌株作為發酵劑是降低食品中BA含量的有效途徑。在發酵食品的發酵劑中，含有AOs的微生物主要是乳酸菌和葡萄球菌。有研究證實具有AOs活性是植物乳桿菌的一般特性[71]。Xie Chong等[72]將植物乳桿菌、木糖葡萄球菌作為香腸的發酵劑，發現木糖葡萄球菌只能輕微地降低酪胺（21%）、組胺（25%）和尸胺（22%）的質量分數，而接種混合發酵劑和植物乳桿菌的實驗組均能有效地降低色胺（100%）、苯乙胺（100%）、腐胺（86%）、尸胺（63%）、組胺（82%）和酪胺（43%）的質量分數，說明植物乳桿菌能強烈地抑制BA的產生，具有高AOs活性。Zhang Huichao等[73]研究發現鼠李糖乳桿菌、枯草芽孢桿菌、腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌、戊糖片球菌以及植物乳桿菌均能夠產AOs，并以此為發酵劑接種到熏馬腸中，研究在香腸成熟過程中這些菌株對BA含量的影響，結果顯示這6 株菌均能不同程度地降解發酵香腸中的BA，降解程度超過40%。Fadda等[74]對53 株乳酸菌BA降解能力的研究表明，干酪乳桿菌和植物乳桿菌具備MAO活性，其中干酪乳桿菌CRL705的MAO活性最高，能降解98%的酪胺。Guarcello等[75]從最具活性的副干酪乳桿菌亞種CB9CT中純化出了BA多銅氧化酶，通過對乳酪中乳酸菌BA降解酶活性的研究發現，編碼多銅氧化酶的基因也存在于其他能降解BA的乳酪發酵劑中。Martuscelli等[17]研究了木糖葡萄球菌對BA的降解能力，發現S81氧化酶活性最高，能100%降解組胺，其次分別為S206（93%）、S79（68%）和S90（53%）。除乳酸菌和葡萄球菌外，從食品中也分離到了其他具有AOs活性的微生物。Lee等[76]將具有AOs活性的多粘芽孢桿菌D05-1作為發酵劑添加到咸魚中，研究在發酵過程中該發酵劑對組胺等BA的降解情況，結果證實該發酵劑不僅能顯著抑制需氧型微生物的生長，還可降低34.0%的組胺以及30.0%的BA總量。表明接種具有AOs活性的發酵劑是減少BA積累的有效方法。真菌中黑曲霉最早被證實具有AOs基因，可在適宜的條件下誘導產生AOs[77]。黃瑤等[78]用黑曲霉AOs的粗酶液分別對自制醬油和市售醬油進行處理，發現在自制醬油中粗酶液對BA的降解率為78.29%，其對市售醬油中BA的降解率為69.5%。

4 AOs的降解特性

目前食品中AOs的應用研究主要集中在發酵劑的篩選中，而從發酵劑中分離純化出AOs并運用于食品的研究較少。為了提高AOs的降解效率及降解活性，必須進一步了解AOs的降解特性。最早研究微生物AOs的是Yamada等[62,79-80]，他們從黑曲霉中分離純化出了一種銅胺氧化酶，并對其特性作了一系列研究，發現每摩爾銅胺氧化酶含有3 g銅離子，其在磷酸鹽緩沖液中穩定，適宜pH值范圍為6.0～7.0，最適溫度為35 ℃，當溫度超過40 ℃時其結構被迅速破壞。透析除去銅離子后，該酶的活性也隨之喪失，當重新添加銅離子后活性恢復，表明在含銅胺氧化酶中，銅離子對酶活性有著重要的影響。隨后，Haywood等[81]以葡萄糖為碳源、一系列胺為唯一氮源，從博伊丁假絲酵母中分離純化出了甲胺氧化酶和芐胺氧化酶，并研究了這兩種初級胺氧化酶的特性，結果顯示芐胺氧化酶在45 ℃和50 ℃時比甲胺氧化酶更加穩定，兩種酶的最適pH值均為7.0，有共同底物，并且兩種酶均對羰基試劑、銅離子螯合劑以及其他DAO抑制劑敏感。研究還證實了這兩種酶具有相對分子質量（relative molecular mass，Mr）約為80 000的相似亞基，但芐胺氧化酶通常為Mr 136 000的二聚體，甲胺氧化酶（Mr 510 000）主要以八聚體的形式存在。2004年，Sekiguchi等[82]從成晶節桿菌KAIT-B-007中分離純化出了熱穩定組胺氧化酶，并研究了其酶學特性。原子吸收光譜結果顯示每摩爾該酶含有1 個銅離子，同時銅離子對組胺氧化酶活性有重要的影響。Foster等[83]通過硫酸銨沉淀、離子交換層析、凝膠過濾等方法從不透明紅球菌中分離純化出了兩種天然含銅AOs，并對這兩種初級胺氧化酶的功能表達和動力學特性進行了研究。通過改變生長底物，發現目標氧化酶活性有不同程度的改變，脂肪族、芳香族胺以及多種結構類似物的米氏動力學常數表明氧化酶具有廣泛的特異性，并且對C1～C5脂肪族單胺和芳香族胺有較高的親和力，米氏常數的范圍為0.1～0.9 mmol/L和小于0.2 mmol/L。研究發現在腐胺降解路徑中，AOs和4-氨基丁酸醛脫氫酶共同作用于腐胺的降解，腐胺氧化酶將腐胺脫氨生成4-氨基丁酸醛，該物質在4-氨基丁酸醛脫氫酶的作用下形成4-氨基丁酸，再在氨轉移酶和脫氫酶的作用下最終形成琥珀酸鹽代謝腐胺[65]。Callejón等[84]分別從植物乳桿菌J16和乳酸片球菌CECT 5930中分離純化出能在葡萄酒中降解腐胺、酪胺、組胺的酶，并鑒定為多銅氧化酶，純化的蛋白對組胺、酪胺、腐胺的降解率分別為36%、80%、17%。克隆植物乳桿菌J16 CECT 8944中降解BA的新漆酶基因并在大腸桿菌中異源過表達，對漆酶的純化和生化表征研究發現，純化的漆酶具有多銅氧化酶活性，主要降解酪胺[84]。

也有報道將AOs添加到食品中研究其對BA的降解情況。黃瑤等[78]研究了黑曲霉AOs的粗酶液，發現在醬油中添加該粗酶液能有效降低BA含量，其最適溫度為35 ℃，最適pH值為7.0，最佳底物為正己胺，并且銅離子對其酶活性有激活作用，乙二胺四乙酸等能抑制其酶活性。Naila等[85]將DAO加入到魚醬（鹽質量分數1%、pH 6.0）中，發現DAO將組胺降解到不可檢測水平（小于0.1 mg/L），且研究結果表明將AOs加入到食品中能有效去除食品中的BA，效果優于微生物。然而發酵食品復雜的環境條件，主要是低pH值的環境在抑制微生物生長繁殖的同時，也降低了大多數AOs的活性。因此采用加入酶的方法來降低食品中BA含量時，需要測定不同食品的適宜環境條件（如pH值）對酶活性的影響。

5 結 語

許多研究對我國傳統發酵食品中BA含量進行了報道，發現通過接種適宜的發酵劑能夠降低食品中BA含量。但當前大量研究表明控制食品的微生物群落尤其是使用不產BA的發酵劑，雖然能降低BA含量，但該方法不能有效抑制污染菌株產生BA。目前國內外對降低BA的研究大多集中在從食品中篩選具有BA降解活性的微生物，并以此為發酵劑，但對于在我國傳統發酵食品中AOs的分離純化，以及將純化后的酶應用于食品并研究其降解特性鮮見報道。雖然有許多研究表明在實驗條件下AOs能有效降解已生成的BA，但在實際的加工操作過程中，食品復雜的環境條件會影響AOs的降解能力；因此，對食品中AOs的分離純化及其降解特性的進一步研究對BA的降解具有重要意義，同時也為發酵食品的質量控制提供了新的思路。