百合鱗片褐變過程中膜脂過氧化研究

闞 娟，萬 冰，解王晶，陳翠翠，劉 俊，金昌海*

（揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127）

百合是我國衛生部審批通過的首批藥食兼用資源，其食用價值和藥用價值日益受到海內外消費者的重視，有很高的市場價值。百合鱗片由許多肉質鱗片組成，鱗片肥厚、營養豐富，具有芳香氣味與微苦滋味，能刺激食欲、幫助消化[1]。但是百合在采后貯藏過程中極易發生褐變[2-3]。Aguilera等[4]提出細胞膜是一種半透性膜，維持著細胞內外滲透壓的平衡，當膜結構遭到破壞時，細胞的區室化被破壞，細胞內容物滲出，使底物滲出，并與酶反應導致褐變。Purev等[5]研究發現，在干旱、光照、重金屬及高滲透壓等逆境下，植物體內過氧化氫酶（catalase，CAT）的表達量及活性都有所提高，說明CAT在植物抗逆方面發揮著重要作用。Siedow[6]通過研究發現，過量的H2O2會對果實細胞產生傷害。脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）啟動并參與膜系統的脂質過氧化進程，加劇細胞膜的降解[7]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）能夠緩解膜脂過氧化反應中代謝產物丙二醛（malondialdehyde，MDA）的積累以及使細胞膜通透性增加，促使果蔬形成防御結構，提高果蔬抗性[8-9]。目前國內外對百合鱗片的研究主要在生物活性和抗氧化等方面[10-12]，對百合鱗莖貯藏過程中褐變的研究主要集中在褐變相關酶類，如有研究認為百合褐變與多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性密切相關[13]。對膜脂過氧化與百合鱗莖褐變之間關系的研究還少有報道，對于百合鱗莖不同層面鱗片貯藏過程中褐變與膜脂過氧化之間的關系研究也鮮見報道。

本研究以宜興卷丹百合作為實驗材料，對新鮮的百合進行剝片處理并分成外層、中層、內層3 部分，并避光貯藏于4 ℃環境中，研究了百合鱗片在貯藏過程中褐變及膜脂過氧化相關指標，為進一步了解百合鱗片褐變與膜脂過氧化之間的關系以及深入研究百合鱗片的褐變機制提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗以宜興卷丹百合（Lilium lancifolium Thunb.）為材料，采自宜興市百合種植基地。

二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒上海碧云天生物技術有限公司；其他試劑均為分析純，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Lambda 35紫外-可見分光光度計 美國Perkinelmer公司；PT-MR-2100高速組織勻漿機 瑞士Kinematica公司；5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；SHJ-A6磁力攪拌恒溫水浴鍋 上海比朗儀器有限公司；CX41RF顯微鏡 日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

采收大小、果色均勻、成熟度基本一致、無機械損傷和病蟲害的產品。采后即刻運往實驗室，對新鮮百合鱗片進行剝片處理，選擇無明顯機械損傷、無蟲害的百合鱗片，將百合鱗片分為外、中、內3 部分，外層即從外向內數1～3 層，內層即由內向外數1～3 層，其余為中層，避光貯藏于4 ℃冰箱中，并于貯藏的第0、3、6、9、12、15天分別取樣測定。

1.3.2 表觀變化的記錄和細胞活力的測定

貯藏過程中每隔3 d取大小相近的各層百合鱗片置于白紙上拍照記錄表觀變化情況。

細胞活力的測定參照Heese等[14]的方法略作修改。隨機取外、中、內百合樣品，切成1 mm左右厚的薄片浸入臺盼藍染液中（V（臺盼藍）∶V（乙醇）∶V（水）∶V（乳酸）∶V（甘油）∶V（苯酚）＝0.067∶1∶1∶1∶1∶1），沸水浴加熱2 min使切片快速染色。冷卻后，將切片浸入適量2.5 g/mL三氯乙醛溶液中，振動脫色過夜。將脫色完成的切片浸入體積分數60%甘油溶液中，用顯微鏡觀察并采集圖片。

1.3.3 褐變度、細胞膜透性和呼吸強度的測定

褐變度的測定按照K u m a r等[15]的方法，以10×OD420nm表示。

細胞膜透性的測定按照Zhang Zhengke等[16]的方法，用相對滲透率表示百合鱗片細胞膜透性，具體計算見下式。

呼吸強度的測定按照Grozeff等[17]的方法，以每小時每千克新鮮組織吸收CO2的質量表示。

1.3.4 內源POD活力的測定

內源POD活力用二氨基聯苯胺DAB顯色試劑盒測定，顯微鏡觀察和采集圖片。

1.3.5 H2O2含量和超氧陰離子自由基（O2－·）產生速率的測定

H2O2含量的測定按照Liu Hong等[18]的方法，H2O2的含量以每克新鮮組織含有的H2O2物質的量表示；·產生速率的測定按照Ren Chunguang等[19]的方法，以每分鐘每克新鮮組織催化羥胺生成NaNO2的物質的量表示·產生速率。

1.3.6 MDA含量和LOX活力的測定

MDA含量測定按照Gao Hui等[20]的方法，單位為μmol/g；LOX活力的測定按照Wang Jinghua等[21]的方法，LOX活力以每分鐘每毫克蛋白引起234 nm波長處吸光度增加0.01為1 個酶活力單位（U）。1.3.7 SOD、CAT活力的測定

SOD活力的測定按照Mahdavian等[22]的方法，1 個SOD活力單位（U）定義為每克新鮮組織每分鐘對氮藍四唑光化還原抑制為50%時消耗的酶量；CAT活力的測定按照Bailly等[23]的方法，以每分鐘每毫克蛋白引起240 nm波長處吸光度減少0.1表示1 個酶活力單位（U）。

1.4 數據處理

所有實驗取樣重復3 次，通過SPSS 17.0軟件對數據進行方差分析，Duncan法進行顯著性檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同部位的百合鱗片在貯藏過程中表觀和細胞活力的變化

圖1 不同部位的百合鱗片在貯藏過程中細胞活力的變化Fig.1 Change in cell activity in different parts of lily bulbs during storage

檢測細胞活力最常用的染色試劑是臺盼藍，未受損的細胞其膜結構完整、活力強，細胞質內不沉淀臺盼藍；而受損甚至死亡的細胞，膜結構被破壞，活力降低，則臺盼藍堆積在細胞內。由圖1可以看出，隨貯藏時間延長，各層百合鱗片的活細胞數量均逐漸減少，但相同貯藏時間的中層鱗片活細胞數量比外層和內層多，細胞活力較強，與圖2表觀變化結果一致。

圖2 不同部位的百合鱗片在貯藏過程中的表觀變化Fig.2 Change in appearance of different parts of lily bulbs

2.2 不同部位的百合鱗片在貯藏過程中褐變度、細胞膜相對滲透率和呼吸強度的變化

從圖3A可以看出，各層百合鱗片的褐變度都隨著貯藏時間的延長呈現明顯的增長趨勢，在0～3 d內各層百合鱗片的褐變度變化不顯著（P＞0.05），但是3 d之后呈顯著性增加。中層百合鱗片褐變度在貯藏過程中總體低于外層和內層鱗片，與表觀變化結果一致。

從圖3B可以看出，隨著貯藏時間的延長，各層百合鱗片的相對滲透率都呈現增長趨勢，但是中層百合鱗片相對滲透率始終低于外層和內層鱗片。除了第6、9天外層和中層百合鱗片相對滲透率差異不顯著外（P＞0.05），在其他貯藏時間各層均呈現顯著性差異。尤其12～15 d時，相對滲透率迅速升高，15 d時內層鱗片相對滲透率達到23.97%，是中層鱗片（15.78%）的1.52 倍。在貯藏過程中，中層百合鱗片細胞膜損傷程度較輕，與細胞活力和褐變度變化結果一致。

從圖3C可以看出，不同層的百合鱗片在貯藏過程中呼吸強度隨著貯藏時間的延長呈現不斷增長的趨勢，中層鱗片增長速率較為緩慢，始終低于外層和內層。貯藏當天各層百合鱗片呼吸強度無顯著性差異，第3天和第15天外層和內層無顯著性差異，但中層顯著低于外層和內層，6～12 d期間各層鱗片呼吸強度呈顯著性增加，可能是采后貯藏期間營養成分的消耗所致。呼吸強度的變化與褐變度及細胞膜透性變化結果一致。

圖3 不同部位百合鱗片在貯藏過程中褐變度（A）、相對滲透率（B）、呼吸強度（C）的變化Fig.3 Changes in browning degree （A）, relative permeability （B） and respiration intensity （C） in different parts of lily bulbs during storage

2.3 不同部位的百合鱗片在貯藏過程中內源POD活力的變化

DAB顯色試劑盒測定內源POD的活力時，棕褐色沉淀的量反映了內源POD的活力，顏色越深表示POD活力越強。由圖4可以看出，在貯藏過程中，隨著貯藏時間的延長，各層百合鱗片細胞內的棕褐色沉淀先增加后減少，表明內源POD活力先升高后降低，貯藏過程中中層百合鱗片的內源POD活力低于外層和內層，其中內層鱗片中內源POD活力最高，與內層鱗片中褐變度較高密切相關。

圖1 不同部位的百合鱗片在貯藏過程中內源POD活力的變化Fig.1 Change in endogenous POD activity in different parts of lily bulbs during storage

2.4 不同部位的百合鱗片在貯藏過程中H2O2含量和O2－·產生速率的變化

圖5 不同部位的百合鱗片在貯藏過程中H2O2含量（A）和·產生速率（B）的變化Fig.5 Change in H2O2 content （A） and· production rate （B） in different parts of lily bulbs during storage

由圖5A可以看出，隨著貯藏時間的延長，各層百合鱗片的H2O2含量均呈現上升趨勢，但是中層鱗片H2O2含量始終低于外層和內層鱗片。在貯藏前9 d，H2O2含量增長相對緩慢，可能是百合受到衰老損傷后引起CAT等酶活力的增加所致；貯藏后期12～15 d，各層鱗片H2O2含量均呈顯著性增加，細胞受到的氧化損傷也逐漸加重，自我修復能力下降導致H2O2含量增加較快，同時加速了組織褐變。

2.5 不同部位的百合鱗片在貯藏過程中MDA含量和LOX活力的變化

圖6 不同部位的百合鱗片在貯藏過程中MDA含量（A）和LOX活力（B）的變化Fig.6 Change in MDA content （A） and LOX activity （B） in different parts of lily bulbs during storage

植物體在遭受逆境傷害或者衰老時，會發生膜脂過氧化現象，最終產物為MDA。由圖6A可以看出，在貯藏過程中，各層百合鱗片的MDA含量均隨著貯藏時間的延長而呈現上升趨勢，但是中層鱗片的MDA含量以及增長速率均低于外層和內層。在貯藏前6 d，MDA含量增長緩慢，中層和內層含量差異不顯著，可能是因為百合在衰老褐變過程中產生的適量H2O2誘導機體作出一系列反應機制抵御了氧化損傷；貯藏后期9～15 d，外層和中層MDA含量呈顯著性升高，而內層鱗片在9～12 d急劇增加，表明貯藏中后期內層鱗片膜脂過氧化作用增強，導致MDA大量積累，加劇了褐變的發生。

LOX活力的增強會加快細胞損傷以及植物體衰老。由圖6B可以看出，隨著貯藏時間的延長，各層百合鱗片的LOX活力均呈先上升后下降趨勢，在貯藏12 d時達到峰值。中層鱗片的LOX活力上升幅度低于外層和內層，且峰值最小，而內層鱗片峰值最大。在貯藏前期0～6 d各層鱗片LOX活力差異不顯著，但9～15 d內層與外層、中層均呈顯著性差異；這與百合內層鱗片褐變嚴重結果一致。LOX活力的上升可能是百合鱗片對衰老等傷害反應的“應答”。

2.6 不同部位的百合鱗片在貯藏過程中SOD活力和CAT活力的變化

圖7 不同部位的百合鱗片在貯藏過程中SOD（A）和CAT（B）活力的變化Fig.7 Change in SOD （A） and CAT （B） activity in different parts of lily bulbs during storage

由圖7A可以看出，各層百合鱗片的SOD活力均隨著貯藏時間的延長呈先上升后下降趨勢，第9天出現峰值，但是中層鱗片的SOD活力始終比外層和內層高，而內層鱗片貯藏中、后期SOD活力急劇下降，可能是膜脂過氧化作用使組織細胞積累大量的活性氧，細胞受到不可逆傷害，自我修復力下降所致。

CAT能將植物體內的H2O2催化分解，降低植物受到的過氧化損傷。由圖7B可以看出，各層百合鱗片的CAT活力均隨著貯藏時間的延長呈先上升后下降趨勢，第9天時CAT活力出現峰值，但是中層鱗片的CAT活力始終高于外層和內層，具有較強清除H2O2的能力。但在貯藏后期CAT活力逐漸下降，組織受到的氧化損傷不可逆，組織修復能力下降，百合鱗片褐變加劇。

3 討 論

百合在貯藏過程中發生的一系列生理變化，最直觀的表現是顏色的變化。褐變主要是因為細胞受到損傷使多酚滲出后被氧化成醌類物質，而醌類物質可進而聚合成“類黑精”，外觀上表現為百合表面顏色的加深。本研究結果表明，百合鱗片采后貯藏過程中褐變程度的增加伴隨著細胞活力的降低和細胞膜的損傷。

POD在過氧化物存在的條件下能催化多種酚類物質的氧化，導致采后果蔬的酶促褐變。植物細胞中內源POD活力常用DAB組織染色法來測定，在細胞內POD等氧化酶的作用下，催化H2O2釋放氧，從而與顯色底物DAB發生氧化反應產生棕褐色沉淀，以棕色物質在細胞內分布的多少來反映內源POD的活力。本研究中，不同部位百合鱗片細胞內POD活力先上升后下降。這與李文香等[24]對梨果實貯藏過程中POD活力的研究結果一致。

植物組織衰老過程中會因為植物代謝產生大量的活性氧攻擊生物膜，造成膜脂過氧化最終產生MDA[25]。細胞膜的相對滲透率可以用來衡量細胞膜被破壞的程度，進而反映膜脂過氧化的程度[26]。本研究結果表明，在貯藏過程中百合鱗片的MDA含量呈上升趨勢，而中層百合鱗片的MDA含量均低于外層和內層，細胞膜的相對滲透率、呼吸強度和MDA含量變化趨勢相同，這表明細胞膜透性、呼吸強度和膜脂過氧化程度呈正相關，隨著貯藏時間的延長，營養物質逐漸消耗，鱗片組織呈衰老狀態；這與Lin Yifen等[26]在龍眼果實中的研究結果相似。

植物的膜脂過氧化需要LOX啟動和參與。本研究中，褐變相對較慢的中層百合鱗片LOX活力較低，上升速率較平緩；褐變最快的內層鱗片在貯藏過程中LOX活力峰值最高且上升速率較快。在對鮮切荸薺[27]和梨[28]的研究中表明，LOX通過對膜的氧化損傷促進了褐變的發生。這與本研究的結果一致，LOX活力與百合鱗片的褐變也密切相關。

SOD和CAT是植物自由基清除系統中的重要保護酶，二者協同作用可以有效阻止活性氧的積累，防止膜脂過氧化，減輕衰老傷害[29-31]。本研究表明，SOD和CAT活力在貯藏初期和中期不斷增強，均在第9天達到高峰，可最大程度清除活性氧，減輕氧化傷害；貯藏后期，隨著細胞受到的氧化傷害不可逆，酶活力降低，膜脂過氧化程度加劇，因而還會繼續產生活性氧[32-33]；其中H2O2和O2－·是最主要的兩種氧自由基，植物在衰老或遭受逆境時，機體內的H2O2含量和O2－·產生速率會呈現上升趨勢。本研究中，百合鱗片中的H2O2含量和O2－·產生速率也隨著貯藏時間的延長而不斷上升，這與草莓[33]和菠菜[34]貯藏過程中活性氧含量的變化研究結果一致。

綜上，在百合鱗片的貯藏過程中，百合鱗片細胞因衰老而造成活性氧積累，導致膜脂過氧化，引起褐變加劇、品質下降；但是植物對逆境（如衰老）的防御機制非常復雜，不同防御反應之間可能會存在相互影響、信號交叉等現象，而根據之前有關百合鱗片貯藏期間酚類物質研究結果推測，不同部位百合鱗片在貯藏過程中褐變程度的差異可能與不同部位酚類物質的含量組成及對膜損傷的防御能力差異相關，具體機制還需要進一步研究。百合鱗片貯藏過程中極易發生褐變，本研究結果證明其褐變與膜脂過氧化造成的膜氧化損傷密切相關。