（－）-β-蒎烯對沙門氏菌的抑菌機制

何靜如，劉 雪，陳文學*，陳衛軍，陳海明

（海南大學食品學院，海南 海口 570228）

近年來，食源性疾病在人們的日常生活中受到越來越多的關注[1]。致病性細菌存在于各種食品中，例如，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等存在于雞蛋、牛肉、雞肉、豬肉、蔬菜、水果甚至飲用水中，嚴重威脅人體的健康狀況[2-3]。為了抑制食品中的致病性細菌對人體的危害，食品防腐劑在食品工業中尤為重要，而常見的食品防腐劑多為一些可能對人體有副作用的化學物質；故尋找真正對人體安全、天然的抑菌物質至關重要[3]。精油是從不同植物的不同部位分離出來的一種混合物[4]，它是由多種化學成分組成，其中較為重要的成分有萜烯類化合物、萜類化合物、芳香族和脂環族化合物，例如α-蒎烯、（－）-β-蒎烯、檸檬烯、C16和C29類的烷烴等[5-7]。據相關文獻報道，精油不僅具有良好的抗氧化性、抗癌性以及抗過敏性，其對單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌都有很好的抑菌效果；且精油作為一種可預防食源性疾病的天然食品添加劑對人體健康幾乎沒有危害[3,8-9]。盡管已經有很多關于精油成分以及精油抑菌活性和機制的研究，如Cui Haiying等[10-11]的研究發現精油可以破壞細胞膜的完整性，使胞內物質如DNA、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）溢出等。但關于精油中究竟是哪種成分起主要作用仍不是十分明晰，也鮮有報道[8]，因此后續對精油的深入研究空間較廣。

Zou Lan等[12]研究了胡椒提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌機制，結果表明胡椒提取物對細菌的細胞結構、ATP含量和三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環中有機酸含量等有影響。而（－）-β-蒎烯存在于各種植物精油中，它也是胡椒提取物中的一種重要成分，更重要的是，有研究表明其具有抑菌、抗抑郁、抗病毒等功效[13]。因此，深入研究（－）-β-蒎烯的抑菌機制，可為其作為一種天然食品防腐劑提供理論依據。

沙門氏菌屬于革蘭氏陰性菌，除雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌外，大多數沙門氏菌可以依靠周身鞭毛運動[14]。沙門氏菌感染可經雞蛋、飲水、加工食品、環境等途徑傳播，不僅對家禽的生存造成威脅，而且被其感染的食品經消化道進入人體內，會對人體健康造成嚴重損害，已引起國際上越來越多的關注和重視[15-16]。因此，找到有效抑制沙門氏菌的天然食品添加劑對人類健康至關重要。

綜上所述，本研究主要探究（－）-β-蒎烯對沙門氏菌的抑菌機制，通過測定最小抑菌濃度（minimum inhibition concentration，MIC）確定其抑菌活性，再通過掃描電子顯微鏡觀察，并分析其對沙門氏菌的電導率、TCA循環中關鍵酶活力和ATP含量的變化趨勢研究其抑菌機理。本研究為預防食源性致病菌對人體的危害提供了新思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

實驗菌種為沙門氏菌，由廣東微生物菌種保藏中心提供。

（－）-β-蒎烯 阿拉丁試劑（上海）有限公司；營養肉湯、瓊脂（均為生物試劑）、琥珀酸脫氫酶活力測定試劑盒、α-酮戊二酸脫氫酶活力測定試劑盒、ATP含量測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇（分析純） 廣州化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

TU1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；ST16R高速冷凍離心機 美國Thermo公司；S-3000掃描式電子顯微鏡 日本日立公司；SPX-288生化培養箱 寧波江南儀器廠，SHA-2恒溫振蕩器 常州奧華儀器有限公司；JYD-650L超聲波細胞粉碎機 上海之信儀器有限公司；DDS-307電導率儀 上海雷磁有限公司；TDZ5-WS多管架離心機上海盧湘儀離心機儀器有限公司；ALPHA 1-2型冷凍干燥機 北京五洲東方科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MIC測定

采用肉湯稀釋法進行MIC的測定[17]。用無菌生理鹽水（NaCl質量分數0.9%）將培養24 h的沙門氏菌稀釋至106～107CFU/mL。在無菌平板中添加2 mL（－）-β-蒎烯溶液（體積分數70%的乙醇溶液溶解），同時加入18 mL溫度為40～60 ℃的固體培養基并迅速往復搖動，使（－）-β-蒎烯含量別為40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 mL/L。以添加相同體積的無菌生理鹽水和體積分數70%乙醇溶液分別作為空白對照組和陰性對照組。取200 μL上述菌懸液在各平板上涂布均勻，于37 ℃恒溫培養箱中倒置培養24 h，以肉眼不見菌生長的（－）-β-蒎烯含量為MIC。

1.3.2 細胞形態的觀察

采用掃描電子顯微鏡觀察沙門氏菌細胞形態的變化[18-19]。向培養至對數期的目標菌懸液中加入（－）-β-蒎烯，使其含量分別為2 MIC、1 MIC、1/2 MIC，以不加（－）-β-蒎烯的作為空白對照組，以加入體積分數70%乙醇溶液的作為陰性對照組。將各組菌懸液置于37 ℃恒溫搖床培養，取培養至8、16 h的菌懸液各50 mL，6 000 r/min低溫離心10 min收集菌體。使用無菌磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）清洗菌體3 次，再用體積分數依次為20%、40%、60%、80%的乙醇溶液進行梯度脫水，每個含量均洗脫2 次，最后用無水乙醇洗脫3 次。將脫水后的樣品在－20 ℃條件下預凍2 h后使用真空冷凍干燥機冷凍干燥12 h。取出完全干燥的樣品，上樣、鍍金、掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.3 電導率測定

采用電導率儀進行測定[20]。將2%沙門氏菌菌懸液（106～107CFU/ mL）接種于150 mL營養肉湯培養基中，搖床振蕩（130 r/min、37 ℃）培養至對數期，再向其中分別加入2 MIC、1 MIC和1/2 MIC的（－）-β-蒎烯溶液；以不加抑制物的為對照組，置于37 ℃搖床中繼續振蕩培養，并分別于0、2、4、6、8、10、12、14 h取出5 mL，4 000 r/min離心15 min，取上清液測其電導率。平行測定3 次。

1.3.4 樣品制備

使用無菌生理鹽水溶液對斜面傳接至4 代的沙門氏菌進行洗脫，采用麥氏比濁管法配制濃度為106～107CFU/mL的菌懸液。分別取體積分數2%的菌懸液加入5 個裝有250 mL營養肉湯培養基的錐形瓶中，置于37 ℃、130 r/min條件下搖床培養至對數期。再向其中添加（－）-β-蒎烯溶液，使其含量分別為2 MIC、1 MIC、1/2 MIC，以添加相應量的體積分數70%乙醇溶液作為陰性對照組，以不添加任何物質的作為空白對照組，繼續搖床培養。培養過程中分別于0、3、6、9、12、24 h取10 mL菌液在4 ℃下11 000 r/min離心10 min，棄上清液，收集菌體，用無菌磷酸鹽緩沖液清洗3 次并重新懸于緩沖液中。在冰浴條件下，使用超聲細胞破碎儀對細菌懸浮液破碎6 min（550 W，間隔10 s），將破碎的懸浮液于4 ℃下11 000 r/min離心10 min，棄下層細胞殘渣，將上清液保存于4 ℃冰箱中以備測定琥珀酸脫氫酶（succinic acid dehydrogenase，SDH）、α-酮戊二酸脫氫酶（α-ketoglutarate dehydrogenase，α-KGDH）活力和ATP含量。

1.3.5 SDH活力測定

SDH活力采用試劑盒進行測定[21]。向相應編號的試管中加入100 μL樣品液，迅速加入2.6 mL工作液，立即混勻并計時，迅速倒入比色皿中，在可見分光光度計600 nm波長處比色，5 s時讀取吸光度A1，在1 min5 s時再次測定吸光度A2，求出2 次吸光度差值ΔA（A1－A2）。樣品蛋白質量濃度測定采用考馬斯亮藍法。并采用公式（1）進行SDH活力計算。

式中：t為反應時間（1 m i n）；V為取樣量（0.1 mL）；ρpr為樣本蛋白質量濃度/（mg/mL）。

1.3.6 α-KGDH活力測定

α-KGDH活力采用試劑盒進行測定。取1.3.4節中的樣品液按照試劑盒說明書進行操作，立即記錄340 nm波長處20 s時的吸光度A1和2 min 20 s時的吸光度A2，以上比色均采用蒸餾水調零；計算ΔA（A2－A1）。并采用公式（2）進行α-KGDH活力計算。

式中：V總為反應體系總體積/L；ε為NADH摩爾消光系數（6.22×103L/（mol·cm））；d為比色皿光徑/cm；V樣為樣本體積/mL；ρpr為樣本蛋白質量濃度/（mg/mL）；t為反應時間/min。

1.3.7 ATP含量的測定

細菌培養過程中ATP含量采用ATP含量測定試劑盒進行測定[22]。取1.3.4節中的樣品液按照試劑盒說明書進行操作，最后在636 nm波長處，用光徑0.5 cm比色皿，以雙蒸水調零，測定各管吸光度。

1.4 數據處理

所有結果均使用DPS 6.5數據分析軟件進行方差分析，結果以平均值±標準差表示。Origin 9.0軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 （－）-β-蒎烯對沙門氏菌的MIC

表1 沙門氏菌生長情況Table1 Growth status of Salmonella

從表1中可以看出，體積分數70%的乙醇溶液對沙門氏菌的生長并無明顯影響，隨著（－）-β-蒎烯溶液含量的逐漸增大，其對沙門氏菌生長的抑制作用也隨之增大，當抑菌物質的含量達到20 mL/L時，沒有菌體生長，即（－）-β-蒎烯對沙門氏菌的MIC為20 mL/L。

2.2 （－）-β-蒎烯對沙門氏菌細胞形態的影響

圖1 （－）-β-蒎烯處理后沙門氏菌的細胞形態Fig.1 Effect of （-）-β-pinene on the morphology of Salmonella

如圖1所示，空白對照組的沙門氏菌細胞呈現正常的桿狀（圖1a），陰性對照組的沙門氏菌細胞形態受到微小破壞，大部分仍呈現正常的短桿狀（圖1b），而（－）-β-蒎烯處理組的沙門氏菌的細胞形態則受到嚴重破壞（圖1c～e）。（－）-β-蒎烯處理16 h后，細胞破裂、黏結在一起，界限模糊，細胞壁和細胞膜被破壞，細胞形態受到嚴重影響，且破壞程度依次為2 MIC＞1 MIC＞1/2 MIC（圖1c～e）。因此，實驗結果表明（－）-β-蒎烯可以破壞沙門氏菌的細胞壁和細胞膜，且含量越大，破壞作用越大。（－）-β-蒎烯造成沙門氏菌的細胞形態及結構的破壞可能會導致胞外的大分子物質可以進入細胞內，細胞內的一些物質也會溢出細胞外，同時細胞的正常代謝途徑也會受到一定程度的影響[18]，最終導致細菌死亡。

2.3 （－）-β-蒎烯對沙門氏菌細胞膜完整性和通透性的影響

圖2 （－）-β-蒎烯對沙門氏菌電導率的影響Fig.2 Effect of （-）-β-pinene on the conductivity of Salmonella

電導率的變化是衡量細菌細胞結構變化的一個重要指標。從圖2中可以看出，不加抑菌物質的沙門氏菌菌液電導率呈現微小上升的趨勢，由0 h的9.88 mS/cm上升到14 h的10.11 mS/cm；而添加（－）-β-蒎烯的菌懸液電導率明顯增大，如2 MIC的菌液電導率由0 h的9.90 mS/cm增加至14 h的11.80 mS/cm；1 MIC的菌液電導率由0 h的9.87 mS/cm增加到14 h的11.67 mS/cm；1/2 MIC的菌液電導率由0 h的9.91 mS/cm增加至14 h的11.21 mS/cm。整個實驗過程中電導率基本為2 MIC＞1 MIC＞1/2 MIC＞空白對照組，這表明（－）-β-蒎烯使沙門氏菌的細胞膜結構遭到一定程度的破壞，膜滲透性發生改變，胞內離子如K＋、Ca2＋、Mg2＋外泄增加，從而導致菌液的電導率增大，且（－）-β-蒎烯的含量越大，對膜結構的破壞作用也就越大，離子泄漏也更加多，這與張赟彬等[23]研究的荷葉精油對沙門氏菌的菌液電導率影響結果相一致。另一方面，在8 h之后，添加抑菌物質的菌液電導率都有一定幅度的下降，這可能是因為此時（－）-β-蒎烯與外泄的離子產生了靜電結合[24]，從而導致離子濃度下降，使電導率降低。

綜合2.2、2.3節中對沙門氏菌細胞形態的觀察以及對菌液電導率變化的研究結果，表明（－）-β-蒎烯對沙門氏菌的細胞形態和結構都會產生一定的破壞作用，會導致細胞變短變粗、破裂、黏結、細胞膜的完整性和通透性發生改變，胞內物質外溢，從而使電導率增大，影響菌體的正常生長和代謝，最終導致死亡，且（－）-β-蒎烯的含量越大，破壞作用越大。

2.4 （－）-β-蒎烯對沙門氏菌TCA中關鍵酶活力的影響

2.4.1 對SDH活力的影響

SDH在TCA循環中主要起到了氧化脫氫的作用，其催化琥珀酸進行脫氫反應，黃素腺嘌呤二核苷酸是該反應的輔基，生成黃素腺嘌呤二核苷酸遞氫體，為細菌細胞的代謝途徑提供能量，從而使整個TCA循環具有可持續性[25-26]。

圖3 （－）-β-蒎烯對沙門氏菌SDH活力的影響Fig.3 Effect of （-）-β-pinene on SDH activity in Salmonella

如圖3所示，空白對照組和陰性對照組的SDH活力變化不明顯；而在（－）-β-蒎烯作用下，實驗組的SDH活力呈現先上升后下降再上升的趨勢。在0～9 h，添加不同含量的（－）-β-蒎烯溶液的實驗組波動不明顯，SDH活力差異也較小；9 h之后，實驗組的SDH活力均呈大幅度增加，且明顯有2 MIC＞1 MIC＞1/2 MIC＞對照組，結果說明隨著培養時間的延長，（－）-β-蒎烯可使沙門氏菌的SDH活力增強，這可能是由于（－）-β-蒎烯作用于SDH活力部位，導致沙門氏菌對（－）-β-蒎烯產生了抵抗作用，從而使SDH活力增大，且（－）-β-蒎烯的含量越高，抵抗作用就越強，SDH活力就增大得越多。

2.4.2 對α-KGDH活力的影響

在TCA循環中α-KGDH酶系催化α-酮戊二酸生成琥珀酰CoA，并產生NADH，將電子提供給呼吸鏈[27]進而產生細菌生長繁殖所需要的能量。α-KGDH酶系包括α-KGDH、二氧硫辛酸琥珀酰轉移酶和二氫硫辛酸脫氫酶3 種酶。

圖1 （－）-β-蒎烯對沙門氏菌α-KGDH活力的影響Fig.1 Effect of （-）-β-pinene on α-KGDH activity in Salmonella

從圖4中可以看出，空白對照組的α-KGDH活力呈波動趨勢，但變化不大，陰性對照組的α-KGDH活力波動變化并最終下降至最低點，而添加（－）-β-蒎烯的實驗組的α-KGDH活力在0～9 h內呈現波動趨勢，在9 h后，則迅速增大，至24 h時增大至最高點，且2 MIC＞1 MIC＞1/2 MIC＞空白對照組＞陰性對照組，說明在（－）-β-蒎烯的作用下，隨培養時間的延長，α-KGDH活力增大，這可能是由于（－）-β-蒎烯對沙門氏菌α-KGDH的基因表達產生影響，使其對抑制物的敏感性增強，從而使α-KGDH活力增大。同時，ATP為該酶的別構抑制劑，當ATP含量充足時，酶活力降低，而當ATP含量下降時，酶活力升高。通常，當細胞凋亡、壞死或在毒性物質作用下時，細胞的膜電位會下降，為了保持細胞的質子動勢平衡，ATP的含量也會急劇下降[28]。因此，在（－）-β-蒎烯的作用下可能導致了α-KGDH活力的增強。

2.5 （－）-β-蒎烯對沙門氏菌細胞內ATP含量的影響

ATP是由一分子腺嘌呤、一分子核糖和三分子磷酸組成的不穩定化合物，其在細胞的各種生理、病理過程中起著十分重要的作用，并且直接為生物體生命活動提供能量。

圖5 （－）-β-蒎烯對沙門氏菌ATP含量的影響Fig.5 Effect of （-）-β-pinene on ATP level in Salmonella

從圖5可以看出，空白對照組和陰性對照組的ATP含量在培養前期處于波動狀態，在培養后期均呈現增大趨勢；而添加（－）-β-蒎烯的實驗組，在0～9 h均呈現先上升后下降的趨勢，2 MIC組在3 h時ATP含量增大到最大值，為359 348.849 μmol/g pro；而1 MIC組和1/2 MIC組則在6 h時增大到最大值，分別為262 332.292 μmol/g pro和179 776.059 μmol/g pro；而在培養后期ATP含量急劇下降，在24 h時ATP含量降至最低，分別為60 975.982（2 MIC）、93 195.885（1 MIC）、107 400.849（1/2 MIC）μmol/g pro。結果表明（－）-β-蒎烯對沙門氏菌生長過程中ATP的形成存在一定程度的影響，會造成ATP含量的下降，這可能是因為在（－）-β-蒎烯的作用下，導致細胞質子動力的降低[29]或者膜電位的降低，阻礙了氫的傳遞與接收[30]，從而使ATP的合成受到了抑制。同時，ATP水平的降低也可能是由于細胞過度凋亡和過度的ATP消耗造成的，因為細胞凋亡是一種依賴于ATP的過程[30]。總之，（－）-β-蒎烯會削弱沙門氏菌的產能能力。

3 結 論

綜合以上（－）-β-蒎烯對沙門氏菌的抑菌機制研究結果，表明（－）-β-蒎烯主要是通過破壞其細胞形態和結構，導致離子的泄漏，增強TCA循環中SDH和α-KGDH的活力以及降低ATP含量來抑制沙門氏菌的正常生長。本研究為之后進一步探究（－）-β-蒎烯和精油中其他成分對食源性致病菌的抑菌機制提供理論支撐和新的思路。