超高壓及三聚磷酸鈉質量分數對肌球蛋白凝膠保水性及熱膠凝過程的影響

錢 暢，薛思雯，徐幸蓮*，周光宏*

（南京農業大學 國家肉品質量安全控制工程技術研究中心，肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，農業部畜產品加工重點實驗室，江蘇高校肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095）

三聚磷酸鈉作為肉制品加工中常用的品質改良劑，能通過改變體系電荷密度的方式促進肌原纖維蛋白的溶解及肌纖維的橫向膨脹，從而提高肉及肉制品的保水性[1]；其還能水解產生焦磷酸鈉，從而使肌動球蛋白解離并提高肌球蛋白的溶解度和提取率[2]。然而，有研究指出，過量攝入磷酸鹽會增加腎臟的代謝壓力并引發諸多疾病[3]。這就要求加工者在保持產品原有性狀的同時盡可能地降低三聚磷酸鈉的添加量。超高壓加工技術可以通過影響鹽離子對蛋白的修飾作用，促進其溶解并增強其水合能力，從而降低肉制品中磷酸鹽的含量，但其作用效果受作用壓力及蛋白種類的影響[4-5]，這說明在高壓條件下磷酸鹽對蛋白的作用機制尚不清晰，需要進一步研究。

保水性是評價肉及肉制品品質的重要指標之一，而肌球蛋白作為肌肉蛋白中占比最高（約25%）且唯一能形成熱凝膠的蛋白[6]，對此起決定性作用。單體肌球蛋白具有不對稱的分子結構（包含雙頭球狀、桿狀與尾部結構域），其頭部有ATP酶的活性位點，尾部主要由α-螺旋組成[6]。在加熱過程中蛋白變性，分子結構展開，因聚合作用形成凝聚體，并最終交聯形成凝膠網絡結構。而在此過程中蛋白結構的展開程度、變性和聚集的速度以及多聚體之間的相互作用等均會影響有序凝膠網絡的形成，并最終改變凝膠的保水性[7]。有學者發現加入氯化鈉和磷酸鹽會分別使蛋白結構域的轉變溫度明顯升高或降低，從而改變蛋白的熱穩定性[8-9]。Speroni等[10]則發現三聚磷酸鈉對高壓肌球蛋白熱變性過程的影響會隨其質量分數和作用壓力的變化而變化。更有研究認為加入到純肌球蛋白體系中的三聚磷酸鈉會改變蛋白的ATP酶活力[11]，從而影響蛋白的熱膠凝過程與形成凝膠的性質。但具體作用方式仍缺乏合理解釋，因此還需進行細致深入的研究。

本研究對含不同質量分數三聚磷酸鈉的兔骨骼肌肌球蛋白進行超高壓處理后程序升溫，篩選出對蛋白凝膠保水性有顯著影響的壓力參數與三聚磷酸鈉質量分數的組合；在該條件下進一步研究超高壓處理和三聚磷酸鈉質量分數對蛋白溶解度、ATP酶活力和升溫過程中蛋白的二級結構含量、表面疏水性、活性巰基含量、靜態流變性及所形成熱凝膠的微觀結構等理化特性的影響。探討凝膠保水性差異的形成原因及磷酸鹽在高壓肌球蛋白體系中的作用機制，為低磷酸鹽健康肉制品的開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

3 月齡雄性新西蘭白兔（2.5～3.0 kg）江蘇省農科院畜牧所；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、腺苷-5’-三磷酸二鈉鹽（adenosine triphosphate，ATP）、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、溴酚藍、β-巰基乙醇（均為色譜純） 美國Sigma公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、超微量Ca2＋-ATP酶測定試劑盒 南京建成生物科技有限公司；氯化鈉、焦磷酸鈉、三聚磷酸鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀（均為分析純） 南京化學試劑公司；5,5’-二硫基雙-2-硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitroben-zoic acid，DTNB）、8-苯胺基-1-萘磺酸（1-anilinonaphthalene-8-sulphonic acid，ANS）（均為分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；聚乙烯真空包裝袋（20 ℃時透氧率為1 cm3/（m2·h）） 南京瑞翼特生物科技有限公司；MD44 36 mm透析袋（截留分子質量為3 500 Da） 合肥新恩源生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Waring高速組織搗碎機 美國思伯明設備有限公司；Ultra Turrax T25高速勻漿器 德國IKA公司；Avanti J-E高速冷凍離心機 美國貝克曼有限公司；MiniProtean3Cell小型垂直電泳槽、PowerPac Basic電泳儀美國Bio-Rad公司；TY-80s脫色搖床 南京大學南達生物技術有限公司；GT-800F凝膠成像系統 日本愛普生公司；S-3000N掃描電子顯微鏡 日本日立公司；MCR 301流變儀 奧地利Physica公司；Spectra Max M2酶標儀 美國分子設備有限公司；圓二色光譜儀英國Applied Physics有限公司；S-IL-100-850-9-W高壓設備 英國Stansted Fluid Power公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取、檢測與蛋白樣品的制備

選用健康的新西蘭雄性白兔，宰前飲水和休息，減少應激。機械擊昏后切斷頸部血管放血，迅速剝皮，去頭、爪及內臟，自來水沖洗去除血跡。瀝干后放入4 ℃冰箱15 min，取腰大肌并剔除可見脂肪及結締組織，切碎。參照Cao Yingying等[12]的操作，于0～4 ℃下提取肌球蛋白，蛋白樣品采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進行檢測分析。SDS-PAGE條件：分離膠質量分數10%，濃縮膠質量分數4%，開始電壓為80 V，進入分離膠后電壓加大至120 V[13-14]，肌球蛋白純度的計算參照Laemmli[15]的方法，通過Quantity One軟件分析蛋白特征條帶的相對OD值。用雙縮脲法檢測肌球蛋白質量濃度。

將蛋白樣品放入20 cm長的透析袋中，分別置于含不同質量分數（0%、0.15%、0.30%、0.45%）三聚磷酸鈉的磷酸鹽緩沖液（1%（質量分數，下同）NaCl、20 mmol/L pH 6.5 KH2PO4/K2HPO4）與含0.30%三聚磷酸鈉的磷酸鹽緩沖液（2% NaCl、20 mmol/L pH 6.5 KH2PO4/K2HPO4）中4 ℃透析20 h，期間每7 h更換1 次透析液，共換3 次。透析完成后再用相應的磷酸鹽緩沖液將蛋白樣品的質量濃度調節至20 mg/mL。

1.3.2 蛋白樣品的超高壓處理及熱凝膠的制備

用真空包裝袋將高壓處理組的蛋白樣品封裝（每袋約50 mL，去除氣泡）。根據本實驗室前期研究[16-17]得到的高壓參數，將蛋白樣品分別在100、200、300 MPa下保壓9 min，腔體溫度為25 ℃。對照組蛋白則置于常壓室溫（（25±1）℃）下9 min。超高壓處理完成后，將對照組和高壓處理組的蛋白溶液均置于0～4 ℃環境下12 h，待其狀態穩定后再用10 mL離心管及玻璃燒杯盛裝，并置于水浴鍋中從20 ℃程序升溫（1 ℃/min）至85 ℃，保溫20 min。將凝膠置于0～4 ℃下過夜（12 h）。

1.3.3 蛋白溶解度的測定

參照Chen Xing等[18]的方法并略作改動，用相應的磷酸鹽緩沖液將靜置12 h后的蛋白溶液稀釋至5 mg/mL，在4 ℃下以20 000×g離心20 min，用雙縮脲法測定上清液的蛋白質量濃度，實驗重復3 次。蛋白溶解度按式（1）計算。

1.3.4 保水性的測定

參照Kocher等[19]的方法并作適當改動。準確稱量加入蛋白溶液前的離心管質量（m1）及加入蛋白溶液后的總質量（m2）。凝膠制備完成后，經4 ℃、8 000×g離心10 min后去除水分，準確稱量余下質量（m3），實驗重復3 次。保水性按式（2）計算。

1.3.5 掃描電子顯微鏡觀察

凝膠樣品的制備參照徐幸蓮[6]的方法，用體積分數4%戊二醛溶液（由25%戊二醛溶液用相應的磷酸鹽緩沖液稀釋得到）固定48 h，用雙面刀片切成均勻小塊（3 mm×3 mm×2 mm），再用不同體積分數（50%、70%、90%、95%、100%）的乙醇溶液進行梯度脫水，放入叔丁醇中置換3 次，每次30 min，再將其冷凍干燥并噴金（10 nm）。利用掃描電子顯微鏡進行觀察，加速電壓為10 kV，每個樣品觀察8 個區域。

1.3.6 ATP酶活力的測定

參照田金河[20]的方法，將蛋白樣品用相應的磷酸鹽緩沖液稀釋至0.1 mg/mL，用超微Ca2＋-ATP酶測定試劑盒測定ATP酶活力，每個處理組均設置測定管和對照管，其中對照管在酶反應結束后再加入蛋白樣品。根據試劑盒操作步驟，采用比色法在636 nm波長處測定ATP酶解反應產生的無機磷物質的量，蛋白的ATP酶活力以ATP酶活力單位表示，即每毫克蛋白每小時分解產生無機磷的物質的量（μmol/（mg·h）），實驗重復3 次。

1.3.7 靜態流變特性的測定

參照Chen Xing等[18]的方法，將蛋白樣品用相應的磷酸鹽緩沖液稀釋至5 mg/mL。儀器采用平行板（上板直徑50 mm），參數設置如下：頻率為0.1 Hz，應變為0.01%，狹縫寬度為0.5 mm，從20 ℃以1 ℃/min升溫至80 ℃，記錄儲能模量（G’）的變化情況。

1.3.8 蛋白質二級結構含量的測定

參照薛思雯等[21]的方法，測定蛋白質在升溫過程中二級結構含量的變化。將蛋白樣品用相應的磷酸鹽緩沖液稀釋至0.3 mg/mL，在200～260 nm波長范圍內測量分子橢圓率，采用20～90 ℃程序升溫（1 ℃/min），計算25、40、55、70、85 ℃下肌球蛋白分子二級結構（α-螺旋、β-折疊、β-轉角以及無規卷曲）的含量。

1.3.9 表面疏水性的測定

參照Chen Xing等[18]的方法并作適當修改，以ANS為熒光探針測定蛋白升溫過程中的表面疏水性變化。將蛋白樣品用相應的磷酸鹽緩沖液稀釋至1 mg/mL，各取4 mL稀釋蛋白液加入10 mL離心管中，每個處理組含15 個樣品，用于在25、40、55、70、85 ℃下的表面疏水性測定。將樣品置于水浴鍋中，從20～85 ℃程序升溫（1 ℃/min），并在5個特定溫度下保溫5 min，后將對應的樣品取出冰浴，防止溫度對蛋白的進一步影響。向冷卻至室溫后的蛋白液中加入20 μL ANS溶液（15 mmol/L ANS溶解于0.1 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液），室溫下反應20 min后使用酶標儀檢測激發波長為375 nm、發射波長為470 nm條件下的熒光強度，以其表征蛋白的表面疏水性，實驗重復3 次。

1.3.10 活性巰基含量的測定

參照Ellman[22]的方法并作適當修改，利用DTNB測定蛋白升溫過程中的活性巰基含量變化，蛋白樣品制備及升溫過程同1.3.9節。向冷卻后的蛋白液中加入20 μL DTNB溶液（10 mmol/L DTNB溶解于0.1 mol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液）。混勻后在暗處4 ℃反應1 h，取上清液并用酶標儀測定其在412 nm波長處的吸光度，并按式（3）計算蛋白中活性巰基的含量（C0），實驗重復3 次。

式中：A412nm為412 nm波長處吸光度；ε為摩爾吸光系數（13 600 L/（mol·cm））；D為稀釋倍數；ρ為肌球蛋白質量濃度/（mg/mL）。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE結果分析

如圖1所示，經測定，肌球蛋白重鏈分子質量約為207 kDa，3 條輕鏈的分子質量分別為18.5、10 kDa和8 kDa，與文獻[23]的報道基本一致，經Quantity One軟件分析計算，肌球蛋白純度約為83%。

圖1 肌球蛋白提取產物SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE prof i le of the extracted myosin from rabbit skeletal muscle

2.2 凝膠保水性結果分析

圖2 超高壓作用壓力和三聚磷酸鈉質量分數對肌球蛋白熱凝膠保水性的影響Fig.2 Effects of UHP and STPP content on WHC of heat-induced myosin gels

肌肉蛋白凝膠的保水性能夠直接影響重組類肉制品的感官特性和出品率，是衡量產品品質的一項重要指標[24]。從圖2中可以看出，經100、200 MPa超高壓處理的蛋白加熱后形成的凝膠的保水性較對照組顯著升高（P＜0.05），在300 MPa時則大幅下降（P＜0.05），這與曹瑩瑩等[25]的研究結果相符。作用于蛋白的外部壓力會影響其分子形態和分子間的相互作用，并改變其凝膠形成過程。有研究報道，200 MPa以下的超高壓處理會促進蛋白構象的展開與分子間作用力的形成，強化蛋白與水間的相互作用[26]；而300 MPa以上的超高壓處理會使蛋白過度變性，弱化其凝膠形成能力，導致凝膠保水性下降[16]。

含0.15%三聚磷酸鈉的蛋白經100、200 MPa超高壓處理后加熱形成的凝膠的保水性顯著下降（P＜0.05）。但隨著三聚磷酸鈉質量分數升高到0.30%，凝膠保水性再次上升，且高于未添加三聚磷酸鈉的處理組，此后無顯著變化（P＞0.05）。徐幸蓮[6]則發現三聚磷酸鈉僅在質量分數達0.75%以上時才會起到提高凝膠保水性的作用。改善凝膠保水性所需的三聚磷酸鈉添加量的差異可能是超高壓處理以及試劑添加方式上的不同所致。蛋白凝膠的保水性與蛋白的溶解度、分子間作用力以及凝膠的微觀結構息息相關。有學者認為，加入到純肌球蛋白體系中的磷酸鹽對體系環境和蛋白熱膠凝過程的影響可能改變凝膠結構，從而導致凝膠保水性的變化[27]。隨著三聚磷酸鈉質量分數的增大，經300 MPa處理的蛋白加熱形成的凝膠的保水性也持續上升，可能是劇烈的壓力作用改變了蛋白頭部亞基結構[16]，磷酸鹽對蛋白的作用機制同時也發生變化。

在100～300 MPa的壓力范圍內，蛋白凝膠的保水性隨著三聚磷酸鈉質量分數從0%升高到0.30%不斷變化，說明在此過程中蛋白的理化特性及熱凝膠的形成過程也明顯改變，此后三聚磷酸鈉質量分數的升高則對保水性無顯著影響（P＞0.05）。故選擇0%、0.15%、0.30%作為三聚磷酸鈉質量分數因素的3 個水平，從蛋白的功能特性和分子結構角度進行深入研究，探討凝膠保水性差異的形成原因。

2.3 蛋白溶解度結果分析

圖3 超高壓作用壓力和三聚磷酸鈉質量分數對肌球蛋白溶解度的影響Fig.3 Effects of UHP and STPP content on solubility of myosin

肌球蛋白是一種鹽溶蛋白，在高鹽濃度下呈可溶狀態[28]。超高壓處理可以通過影響鹽離子對蛋白的修飾作用促進其溶解，從而增強其凝膠能力[29]。從圖3中可以看出，未添加三聚磷酸鈉的蛋白經100、200 MPa處理后，其溶解度較對照組顯著上升（P＜0.05），這與Yamamoto等[30]的研究結果相符。但加入了0.15%三聚磷酸鈉的蛋白經超高壓處理后，其溶解度較對照組明顯降低（P＜0.05）。徐幸蓮[6]也報道了在低離子強度體系中，加入0.25%三聚磷酸鈉會導致溶液濁度顯著上升。當三聚磷酸鈉質量分數升高到0.30%時，蛋白的溶解度再次上升，并顯著高于未添加三聚磷酸鈉的處理組（P＜0.05），其中以經100 MPa超高壓處理的含0.3%三聚磷酸鈉的蛋白的溶解度最高。這說明當質量分數較低時，三聚磷酸鈉會呈現出對高壓促溶效應的拮抗作用。而隨著添加量的增大，這種拮抗作用逐漸消失，蛋白的親水作用加強，溶解度提高。當壓力升高到300 MPa時，蛋白的溶解度顯著下降（P＜0.05）。這與文獻[31]的報道相符，說明劇烈的壓力作用加劇了疏水基團的暴露[32]，疏水相互作用的增強促進了蛋白分子的聚集[33]。

2.4 ATP酶活力結果分析

圖1 超高壓作用壓力和三聚磷酸鈉質量分數對高壓肌球蛋白ATP酶活力的影響Fig.1 Effects of UHP and STPP content on ATPase activity of myosin

肌球蛋白的ATP酶活力與其構象緊密相關，故常作為衡量蛋白變性程度的一項指標[34]。從圖4中可以看出，與對照組相比，經超高壓處理后未添加三聚磷酸鈉的蛋白的ATP酶活力顯著降低（P＜0.05），且隨著作用壓力的升高不斷下降，300 MPa時各處理組蛋白的ATP酶活力接近于0。這與Yamamoto[35]和Iwasaki[36]等的研究結果相符，說明超高壓處理會使肌球蛋白的ATP酶活力降低乃至喪失。ATP酶的結合位點位于蛋白頭部的S-1亞基上，其活性中心是半胱氨酸的巰基[24]，超高壓處理破壞了蛋白的天然結構，促使其頭部亞基解離并在疏水作用的參與下進一步聚集[26]。這會導致酶的結合位點或活性中心被包裹或遮蔽，其活力也隨之下降[35]。300 MPa時蛋白ATP酶活力的喪失也說明其頭部變性的程度較高，與前人的研究結果[17]吻合。

含0.15%三聚磷酸鈉的蛋白經100、200 MPa超高壓處理后，其ATP酶活力顯著升高（P＜0.05），說明低質量分數（0.15%）的三聚磷酸鈉對超高壓誘導蛋白頭部變性有拮抗作用。但三聚磷酸鈉質量分數升高到0.30%后，蛋白的ATP酶活力顯著下降（P＜0.05），說明蛋白頭部的變性程度再次增大。許多學者研究發現ATP和三聚磷酸鈉均能與肌球蛋白頭部S-1亞基結合[27,37]，且兩者的磷酸基團連接方式相同，具有結構相似性[38]。Blum[39]認為三聚磷酸鈉可能與肌球蛋白的ATP酶位點間存在特異性結合，并能改變其ATP酶活力。Xiong Youling L.等[2]則認為ATP酶具有水解三聚磷酸鈉的能力。Jin Hongguo等[40]發現肌球蛋白的S-1亞基同時具有ATP酶和三聚磷酸酶活力，但兩者的活性中心并不相同，且三聚磷酸酶的活力更高。綜合已有的研究及本實驗的結果，推測在三聚磷酸鈉質量分數較低時，它會與三聚磷酸酶的活性中心發生特異性結合；但由于三聚磷酸鈉與ATP的結構相似，處于同一結構域的ATP酶的活性位點同時也會被誘導暴露或活化，從而導致ATP酶活力的升高。隨著三聚磷酸鈉質量分數的上升，多余的三聚磷酸鈉無法與相應的酶位點結合并水解（受位點數量及水解反應速率的限制）[11,41]，只能發生電離，因此體系的離子強度增大且pH值升高。林麗軍[42]的研究顯示肌球蛋白的ATP酶活力在低離子強度和pH 5.5環境中達到最高，但隨著離子強度和pH值的升高而下降，故蛋白的ATP酶活力在三聚磷酸鈉質量分數升高到0.30%時再次下降。

2.5 表面疏水性和活性巰基含量結果分析

表1 超高壓作用壓力和三聚磷酸鈉質量分數對肌球蛋白升溫過程中表面疏水性的影響Table1 Effects of UHP and STPP content on surface hydrophobicity of myosin during heating

表2 超高壓作用壓力和三聚磷酸鈉質量分數對肌球蛋白升溫過程中活性巰基含量的影響Table2 Effects of UHP and STPP content on reactive sulfhydryl group content of myosin during heating

疏水基團和巰基在肌球蛋白受熱變性凝聚的過程中起重要作用[6]。表1、2分別顯示了高壓肌球蛋白在升溫過程中疏水基團和包埋巰基基團的暴露情況。可以看出，與對照組相比，經超高壓處理后未添加三聚磷酸鈉的蛋白在加熱前（25 ℃）的表面疏水性和活性巰基含量均顯著升高（P＜0.05），且隨著壓力的增大呈上升趨勢。這與前人的研究結果一致[12]，壓力作用會導致部分維持蛋白三級結構穩定性的非共價鍵斷裂，暴露出包埋的氨基酸殘基。含0.15%三聚磷酸鈉的蛋白經100、200 MPa處理后，其表面疏水性和活性巰基含量顯著低于其他兩組（P＜0.05），說明低質量分數的三聚磷酸鈉會拮抗超高壓處理對蛋白分子構象的改變。Fernández-Martin等[43]也認為磷酸鹽的加入會削弱高壓處理后蛋白分子間形成的疏水相互作用。隨著三聚磷酸鈉質量分數進一步升高，蛋白在加熱前的表面疏水性和活性巰基含量再次顯著上升（P＜0.05），說明磷酸鹽對超高壓處理的拮抗作用逐漸消失，蛋白的三級結構發生變化。

當溫度升高到40 ℃后，100、200 MPa各處理組蛋白的表面疏水性和活性巰基含量均呈顯著上升趨勢（P＜0.05），但變化速率仍有差別。在40～55 ℃的溫度區間內，100 MPa 0.30%三聚磷酸鈉處理組蛋白的表面疏水性和活性巰基含量的變化速率最高（分別為20.23 ℃－1和13.92 μmol/（100 mg·℃））；200 MPa 0.30%三聚磷酸鈉處理組其次。而100 MPa 0.15%三聚磷酸鈉和200 MPa 0.15%三聚磷酸鈉處理組的變化速率則是同壓力處理組中最低的，且其蛋白的的表面疏水性和活性巰基含量在55 ℃后無顯著變化（P＞0.05）。這說明低質量分數的三聚磷酸鈉會抑制高壓肌球蛋白在加熱過程中的三級結構變化以及疏水基團和隱藏巰基的暴露；而三聚磷酸鈉質量分數的升高促進了升溫過程中蛋白高級構象的展開及所包埋基團的暴露。這也是蛋白形成具有良好保水性的凝膠的關鍵[7,16]，在溫度和氧化劑的作用下，蛋白分子間形成疏水相互作用，暴露的巰基也被氧化成二硫鍵[12]。這有助于蛋白凝聚體及有序凝膠結構的形成，大量的水分子被吸引并被包裹在三維凝膠網絡中[16]，凝膠的保水性因此上升。300 MPa時各處理組蛋白的表面疏水性和活性巰基含量在加熱過程中無明顯變化，說明超高壓處理使蛋白過度聚集，抑制了蛋白結構內疏水基團和巰基的暴露[16]。

2.6 超高壓作用壓力、三聚磷酸鈉質量分數間的交互作用情況

由表3可知，超高壓作用壓力對加熱前的蛋白溶解度以及最終熱凝膠保水性有顯著影響（P＜0.05），對其他指標有極顯著影響（P＜0.01）；三聚磷酸鈉質量分數則對所有指標有極顯著影響（P＜0.01）。這與Villamonte等[4]報道的結果相符，說明超高壓作用壓力和三聚磷酸鈉質量分數的變化均會改變高壓肌球蛋白的空間構象，引起蛋白分子間化學作用力的變化，從而影響所形成凝膠的保水性，而兩者間的交互作用對各項指標也均有極顯著影響（P＜0.01），說明不同壓力條件下三聚磷酸鈉質量分數改變引起的蛋白性質變化也不盡相同。

表3 超高壓作用壓力、三聚磷酸鈉質量分數及其交互作用對肌球蛋白的理化性質和凝膠保水性的影響Table3 Effects of UHP, STPP content and their interaction on physicochemical properties of myosin and WHC of formed gel

2.7 蛋白二級結構含量分析

從表4可以看出，在加熱前（25 ℃），經超高壓處理的未添加三聚磷酸鈉的肌球蛋白中α-螺旋結構含量顯著低于對照組（P＜0.05），且隨著作用壓力的升高不斷降低。而含0.15%三聚磷酸鈉的蛋白經100、200 MPa處理后，其α-螺旋結構含量較不含三聚磷酸鈉的處理組顯著上升（P＜0.05），但在三聚磷酸鈉質量分數達到0.30%后再次下降（P＜0.05）。壓力作用帶來的體積壓縮會削弱維持α-螺旋結構穩定的分子內氫鍵和離子鍵，導致其含量不斷下降[44]。有報道稱三聚磷酸鈉對此有拮抗作用[43]。但隨著三聚磷酸鈉添加量的升高，離子強度增大，蛋白尾部分子鏈展開，α-螺旋結構含量再次減小[45]。

隨著溫度不斷上升，各處理組蛋白中α-螺旋結構含量均顯著降低（P＜0.05），而β-折疊和無規卷曲含量隨之升高，其中蛋白二級結構含量在40～55 ℃間的變化幅度最大。在此區間內，100 MPa 0.30%三聚磷酸鈉處理組的α-螺旋結構含量的下降速率最高（1.41%/℃），200 MPa 0.30%三聚磷酸鈉處理組次之（1.36%/℃），而100 MPa 0.15%三聚磷酸鈉和200 MPa 0.15%三聚磷酸鈉處理組蛋白的二級結構含量雖呈現類似的變化趨勢，但其下降速率降低，說明低質量分數的三聚磷酸鈉會抑制加熱過程中蛋白二級結構的轉變。曾淑薇等[46]的研究發現添加質量分數0.30%以上的磷酸鹽會促進蛋白的溶解，增大蛋白分子間空間距離，從而加速蛋白尾部的解螺旋。而蛋白二級結構的轉變也促進了其高級結構的改變，并導致蛋白表面疏水性和活性巰基含量的變化。300 MPa時各處理組蛋白的二級結構含量在升溫過程中的變化幅度減小，說明蛋白的熱敏性降低，蛋白尾部的解折疊程度也下降。這可能與此壓力條件下蛋白的過度聚集有關[33]。

表1 超高壓作用壓力和三聚磷酸鈉質量分數對肌球蛋白升溫過程中蛋白二級結構含量的影響Table1 Effects of UHP and STPP content on the contents of secondary structures of myosin during heating

2.8 蛋白流變特性分析

圖5 超高壓作用壓力和三聚磷酸鈉質量分數對肌球蛋白升溫過程中G’（A）及其變化速率（B）的影響Fig.5 Effects of UHP and STPP content on G’ （A） and the rate of change in G’ （B） during heating

從圖5可以看出，未添加三聚磷酸鈉的蛋白經100、200 MPa處理后G’和變化速率dG’/dT的首個峰值溫度較對照組均上升了2～3 ℃，這與Liu Gang等[47]的研究結果相符，說明超高壓處理使蛋白頭部的變性凝聚過程延后，這促進了該部分結構域的展開，有助于蛋白頭部亞基的相互結合與聚集[26]。因此G′的首個峰值較對照組有所提升。

含0.15%三聚磷酸鈉的蛋白經100、200 MPa超高壓處理后再加熱，G’與dG’/dT的首個峰值溫度較未添加三聚磷酸鈉的處理組上升了3 ℃，且G’與dG’/dT的首個峰值也明顯降低，說明低質量分數的三聚磷酸鈉提升了蛋白頭部結構域的熱穩定性。文獻[48-49]報道了三聚磷酸鈉對肌球蛋白熱穩定性的增強作用，其多表現為增加最大熱吸收峰的溫度及變性焓值。Speroni等[10]認為這種保護作用源于磷酸根離子的Hofmeister效應及其與肌球蛋白頭部ATP酶位點的特異性結合；Henry[50]和Shriver[51]等的研究則顯示磷酸鹽會提高蛋白的ATP酶活力并抑制其頭部受熱變性，從而影響蛋白進一步的凝集。三聚磷酸鈉質量分數升高到0.30%時，G’與dG’/dT的首個峰值溫度再次下降，且G’與dG’/dT的首個峰值均得到回升，這與Speroni等[10]的研究結果相符，說明蛋白頭部的熱變性得以恢復乃至被促進。這可能是因為三聚磷酸鈉的特異性結合位點飽和，其電離出的磷酸根離子與蛋白側鏈上的帶電基團結合，破壞了離子鍵，導致蛋白的熱穩定性降低[11]。隨著溫度升高到55 ℃，100 MPa 0.30%三聚磷酸鈉和200 MPa 0.30%三聚磷酸鈉處理組蛋白的G’逐漸降低，dG’/dT也出現負峰。說明蛋白尾部結構域的變性打破了之前形成的初步交聯結構，蛋白的彈性模量下降[52]。但此時蛋白尾部結構的充分解折疊會促進接下來的尾-尾交聯，故60 ℃后含0.30%三聚磷酸鈉的蛋白的dG’/dT高于含0.15%三聚磷酸鈉的蛋白。100 MPa 0.30%三聚磷酸鈉處理組蛋白的最終G′最高，說明其形成的凝膠結構儲存彈性形變能量的能力最強。

經300 MPa處理的蛋白在40～55 ℃間無G’及dG’/dT的正峰，說明其頭部聚集及弱凝膠形成的階段消失，這可能與過高的壓力導致蛋白頭部的聚集能力受損有關[53]。該壓力條件下三聚磷酸鈉質量分數的變化對G’及dG’/dT的峰值、首個峰值溫度以及蛋白的最終G’無明顯作用。結合前文ATP酶活力的結果，推測蛋白頭部天然構象被破壞從而導致磷酸鹽的特異性結合位點消失是其主要原因。

2.9 凝膠微觀結構分析

圖6 超高壓作用壓力和三聚磷酸鈉質量分數對肌球蛋白熱凝膠微觀結構的影響Fig.6 Effects of UHP and STPP content on microstructure of heat-induced myosin gels

圖6 是利用掃子顯微描電鏡觀察的高壓肌球蛋白熱凝膠的微觀結構。可以看出，經100 MPa超高壓處理的未添加三聚磷酸鈉的蛋白加熱后形成的凝膠由許多絲狀結構交聯而成，與對照組相比，其結構中的網孔大小及分布較為均勻，這也與Wang Mengyao等[54]的研究結果一致。而隨著0.15%三聚磷酸鈉的加入，原本有序的凝膠結構變得雜亂，其中有形狀不規則的大孔洞，表面也出現斷裂的絲狀結構。文獻[27]顯示低質量分數的三聚磷酸鈉會促進蛋白凝聚成交聯軸而非顆粒，使交聯軸變粗、變大，孔洞增大，凝膠微觀結構的致密性下降。而當三聚磷酸鈉質量分數升高到0.30%時，有序的凝膠網絡結構再次形成，且其中包含了疊加的次級網絡結構，這使蛋白分子與水相的整體接觸面積變大，蛋白與水之間的相互作用也得到增強；凝膠中的大量小孔徑結構還能有效地束縛水分[55]，故凝膠的保水性得到改善，凝膠結構對彈性形變的應力提高。Jao等[56]的研究也發現當超過50%的ATP酶失活時，高壓肌球蛋白能夠形成良好的凝膠網絡結構，這也與前文ATP酶活力的結果一致。三聚磷酸鈉質量分數為0.30%的肌球蛋白經100、200 MPa超高壓處理后，其溶解度和ATP酶活力改變，升溫過程中蛋白結構域充分展開并形成交聯，促進了分子間相互作用力的形成。這有利于有序凝膠網絡的形成，并最終使凝膠的保水性得到提升。

3 結 論

不同壓力條件下的超高壓處理和蛋白體系中三聚磷酸鈉的質量分數均會影響肌球蛋白的結構與溶解度、ATP酶活力等理化特性，并改變其熱膠凝過程中的變性速率及交聯方式，最終導致凝膠保水性的變化。100、200 MPa超高壓處理后，含0.15%三聚磷酸鈉的肌球蛋白的溶解度顯著下降，ATP酶活力顯著上升（P＜0.05）。低質量分數三聚磷酸鈉呈現出對超高壓處理的拮抗作用，蛋白在升溫過程中的分子構象變化也受抑制。而隨著三聚磷酸鈉質量分數升高到0.30%，拮抗作用消失，升溫過程中蛋白的結構充分展開，疏水基團與所包埋的巰基快速暴露，蛋白連結形成有序的凝膠網絡結構，凝膠的保水性也顯著上升（P＜0.05）。而300 MPa超高壓處理會使蛋白的溶解度大幅下降（P＜0.05），ATP酶活力喪失，蛋白在升溫過程中的變性與解折疊程度低，形成的分子間交聯弱，最終導致凝膠保水性的顯著下降（P＜0.05）。