超高壓脲包法提高模擬亞麻籽油中多不飽和脂肪酸分離效率

朱凱莉，陳婧超，范清蘋，惠愛玲*

（合肥工業大學食品科學與工程學院，安徽 合肥 230009）

亞麻籽油含豐富的不飽和脂肪酸，其中以亞油酸和亞麻酸為主的多不飽和脂肪酸（poly unsaturated fatty acids，PUFA）質量分數高達60%以上[1]。亞油酸和亞麻酸是人體必需脂肪酸，其在治療皮炎、風濕性關節炎、心血管疾病、高血壓、哮喘、過敏癥和抑制腫瘤生長方面具有一定功效[2-5]。因此，對亞麻籽油中亞油酸和亞麻酸的分離純化或富集研究尤為重要。尿素包合法（脲包法）是分離純化亞油酸、亞麻酸等PUFA的常用方法[6-7]。脲包法對設備要求簡單，且易操作，但存在包合時間長[8-10]、產品得率低[11-12]、單不飽和脂肪酸與PUFA選擇性差[13]等缺點。為此，一些研究者對傳統脲包（低溫脲包、冷凍脲包）過程加以改進，如采用多次包合[14-15]、緩慢降溫[16]、離心[17]、溶劑結晶法和脲包法聯用[18]、脲包法與選擇性加氫結合[19]等方法提高PUFA的純度；通過響應面優化試驗[20]、攪拌梯度冷卻結晶[21]以縮短包合時間；采用快速降溫（1 min內將溫度從室溫降到－60 ℃）使游離脂肪酸的分離更具有選擇性[22-24]；采用超聲波處理以提高重質油中鏈烷烴和環烷烴分離效果[25]。以上改進措施在某種程度上提高了傳統脲包法的分離效率，但產品得率仍然偏低。

Brown等[26]研究發現施加一定壓力可使2,10-十一烷二酮-尿素包合物結構發生一些不可逆的變化。高壓處理對飽和脂肪酸的影響較不飽和脂肪酸更為顯著[27]。袁野等[28]采用低溫協同超高壓脲包法分離大豆油脫臭餾出物中飽和脂肪酸乙酯工藝，當脲包混合液在4 ℃下預冷90 min并用300 MPa超高壓處理60 min時，非包合相（濾液）中飽和脂肪酸乙酯質量分數由15.22%減少至2.83%，不飽和脂肪酸乙酯質量分數由37.65%提高至60.01%。以上研究結果提示，將高壓技術引入傳統脲包過程，有望取得與冷凍脲包法類似的分離效果，并可能大幅縮短包合周期。

本研究以模擬亞麻籽油混合脂肪酸（fatty acid mixed，MFA）為研究對象，采用超高壓脲包法富集PUFA，優化包合工藝參數以提高PUFA的分離效率；采用差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀和掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）研究壓力對尿素包合物晶體熱力學性質與晶體形貌的影響，初步解析超高壓處理提高PUFA分離效率的機理，為超高壓技術應用于油脂PUFA分離提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸 合肥博美生物科技有限責任公司；棕櫚酸甲酯（99.0%）、硬脂酸甲酯（98.5%）、油酸甲酯（99.0%）、亞油酸甲酯（99.4%）、亞麻酸甲酯（98.0%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；十七烷酸甲酯 美國Uu-chek公司；尿素、鹽酸、體積分數95%乙醇溶液、無水甲醇、濃硫酸、正己烷 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

YCB630/2.5型食品超高壓處理裝置 中國兵器工業第五二研究所；Claus 600氣相色譜儀（gas chromatography，GC） 珀金埃爾默儀器（上海）有限公司；Q200 DSC儀 美國TA公司；SU8020場發射SEM日本日立公司；X’Pert Pro MPD X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀 荷蘭帕納科公司。

1.3 方法

1.3.1 亞麻籽油MFA制備

模擬亞麻籽油中MFA體系，將5 種主要脂肪酸（棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸，其中亞油酸、亞麻酸為PUFA）按一定比例混合均勻。GC定量檢測顯示其質量比為7∶5∶19∶15∶54。

1.3.2 脲包法富集亞麻籽油中PUFA

低溫脲包法流程為：尿素、95%（體積分數，下同）乙醇溶液、MFA混合→85 ℃加熱回流→攪拌30 min→于4 ℃放置18 h→待抽濾處理。

冷凍脲包法流程為：尿素、95%乙醇溶液、MFA混合→85 ℃加熱回流→攪拌30 min→于－18 ℃放置18 h→待抽濾處理。

超高壓脲包法流程為：尿素、95%乙醇溶液、MFA混合→85 ℃加熱回流→攪拌30 min→于聚乙烯袋中冷卻30 min→待高壓處理。

預實驗發現超高壓處理之前的預冷卻溫度及超高壓處理的保壓時間對PUFA分離效果影響較小，從使包合物充分結晶且經濟實用的角度考慮，選擇高壓處理之前在20 ℃下冷卻30 min，保壓20 min。因此，本研究僅考察不同尿素/MFA質量比及壓力大小對非包合相（濾液）中PUFA富集效果及包合相中PUFA非選擇性包合的影響。

尿素/MFA質量比的影響：固定MFA2 g、95%乙醇溶液14 mL，尿素用量分別為1、2、3、4 g，脲包混合液在20 ℃下冷卻30 min，之后在300 MPa下保壓20 min使其結晶。

壓力大小的影響：固定MFA2 g、95%乙醇溶液14 mL、尿素3 g，脲包混合液在高壓前于20 ℃冷卻30 min，其后分別采用0.1、100、200、300、400 MPa壓力保壓20 min使其結晶。

1.3.3 包合相及非包合相中PUFA得率的測定

對脲包法得到的包合物立即進行抽濾，分別得到包合相（晶體）及非包合相（濾液）。將包合相晶體晾干，取1 g置于10 mL具塞試管中，加入3 mL體積分數15%鹽酸溶液置于50 ℃水浴至晶體完全溶解[29]，用正己烷萃取脂肪酸，減壓濃縮得包合相脂肪酸。將非包合相中濾液減壓濃縮除去乙醇，加入正己烷萃取脂肪酸，水洗去除尿素，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得非包合相脂肪酸。將上述脂肪酸分別甲酯化后用GC定量檢測其中PUFA質量分數，并按下式計算非包合相PUFA得率（Yf）。

式中：mf表示非包合相中M F A的質量/g；ωf表示非包合相中P U F A的質量分數/%；m表示原料中M F A的質量/g；ω表示原料中PUFA的質量分數/%。

脂肪酸甲酯化：取脂肪酸200 mg，加入1 mL甲醇和0.1 mL濃硫酸，混勻后65 ℃水浴加熱1 h，加入1 mL正己烷，離心，保留上清液待用。取上清液20 μL，加入200 μL含3 mg/mL十七烷酸甲酯（內標物）的正己烷溶液，并用正己烷定容至0.5 mL，過0.22 μm有機濾膜，待GC檢測。

GC檢測條件：PE Elite-WAX ETR 毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度300℃；空氣流速400 mL/min，氫氣流速40 mL/min；進樣口溫度250 ℃；載氣流速1 mL/min；分流比12∶1；進樣量0.5 μL；升溫程序：200 ℃保持10 min。

1.3.4 PUFA質量分數的GC定量檢測

方法特異性：對加入內標物前后的MFA進行GC分析，具體方法如下。以正己烷為溶劑，配制質量濃度為3 mg/mL的十七烷酸甲酯溶液。取兩份200 mg MFA甲酯化并稀釋后的上清液，其中一份加入200 μL十七烷酸甲酯溶液，另一份加入等體積的正己烷，利用GC檢測。

標準曲線：分別取一定質量的棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯標準品，用正己烷混合溶解，每種脂肪酸甲酯的質量濃度分別為6.0、4.0、9.6、8.6、10.0 mg/mL。用正己烷稀釋成7 個質量濃度梯度的MFA甲酯標準品溶液，內標物質量濃度均為1.2 mg/mL，GC檢測，以每種脂肪酸甲酯標準品與內標物的峰面積比（y）對每種脂肪酸甲酯溶液質量濃度（x/（mg/mL））進行線性回歸分析，求得5 種脂肪酸甲酯在相應質量濃度范圍內的標準曲線，其相關系數（R）應大于0.99。

精密度實驗[30]：用正己烷將MFA甲酯標準品溶液稀釋至棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯質量濃度分別為1.20、0.80、1.92、1.72、2.00 mg/mL，其中內標物質量濃度為1.2 mg/mL，用GC對其重復測定6 次，比較測定結果。

回收率實驗[31]：本研究采用加標回收法測定回收率，取已知質量濃度的MFA甲酯樣品，加入5 種脂肪酸甲酯標準品，使棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯標準品質量濃度相對于已知質量濃度分別增加0.5、0.5、1.5、1.5、4.0 mg/mL，每種樣品取6 份作為平行樣，采用GC內標法定量檢測，通過每種標準品的加入量和檢出量評價回收率。

穩定性實驗[32]：取處理后的MFA樣品，24 h內每隔2 h取待測液進行GC檢測。

1.3.5 包合相晶體分析

DSC分析：準確稱取3 mg包合物晶體放入鋁制坩堝中，密閉放入樣品池中，并用空白坩堝作對照。設置程序升溫樣品初始溫度80 ℃，以10 ℃/min的速率升溫至160 ℃。場發射SEM觀察：參考鉏曉艷等[33]的方法。XRD分析：參考陳迪釗等[34]的方法并略作改動，掃描范圍為7°～40°。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 PUFA質量分數的GC定量分析

圖1 MFA甲酯未加（A）/加（B）內標物的比較Fig.1 Chromatograms of MFA methyl esters without （A）/with （B）internal standard substance

圖1 A是模擬亞麻籽油中5 種主要脂肪酸的GC圖譜，圖1B是加入內標物十七烷酸甲酯后的圖譜。可以看出十七烷酸甲酯與被檢測脂肪酸有明顯的分離，且其保留時間處于5 種脂肪酸中間，適于作為脂肪酸質量分數定量檢測的理想內標。

棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯在0.12～6.00、0.08～4.00、0.19～9.60、0.17～8.60、0.20～10.00 mg/mL質量濃度范圍內的線性回歸方程分別為y＝0.705 0x＋0.029 8、y＝0.774 3x＋0.020 8、y＝0.817 1x＋0.053 5、y＝0.806 5x＋0.033 1、y＝0.779 2x＋0.050 7，R在0.997 6～0.998 5之間，線性關系良好，說明該實驗方法可用于亞麻籽油中5 種脂肪酸質量濃度的準確測定。精密度實驗結果得出5 種脂肪酸甲酯的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均小于2%，表明本方法可靠、準確，具有重復性；回收率實驗中5 種脂肪酸定量分析的回收率在94.44%～103.28%之間，符合實驗要求，被測脂肪酸的RSD均小于3%，重復性較好；穩定性實驗結果中5 種脂肪酸甲酯的質量濃度RSD均小于4%，表明脂肪酸甲酯樣品在24 h內比較穩定。

2.2 超高壓脲包法分離富集PUFA分析

2.2.1 尿素/MFA質量比分析

在傳統脲包法分離過程中，尿素/脂肪酸質量比決定了尿素-脂肪酸包合物的形成，并最終影響飽和脂肪酸的包合效果[35]。在超高壓脲包法分離中，隨著尿素/MFA質量比的增加，非包合相中PUFA質量分數逐漸增加。如圖2所示，當尿素/MFA質量比達4∶2時，非包合相中PUFA質量分數由MFA中的69%增加至99.16%。與此同時，包合相中也檢測到50.59%的PUFA，即大于50%的PUFA被非選擇性包合，這一結果也可從非包合相中PUFA得率僅為36.62%得以印證。而當尿素/MFA質量比為3∶2時，盡管非包合相中PUFA質量分數（96.05%）與質量比4∶2（99.16%）時相比略有降低，但非包合相中PUFA得率高達81.81%，這得益于PUFA在尿素/MFA質量比為3∶2時被非選擇性包合的損失（37.87%）與質量比4∶2（50.59%）時相比有所降低。綜合考慮PUFA質量分數及得率，選擇尿素/MFA質量比為3∶2且尿素-MFA與95%乙醇溶液料液比為5∶14進行后續實驗。

圖2 尿素/MFA質量比對PUFA分離效果的影響Fig.2 Effect of urea/MFA ratio on separation eff i ciency of PUFA

2.2.2 超高壓處理壓力分析

圖3 處理壓力對PUFA分離效果的影響Fig.3 Effect of pressure on separation eff i ciency of PUFA

一般認為：脂肪酸與尿素包合過程是一個反應結晶（沉淀）過程，超高壓處理有助于促進尿素-脂肪酸包合結晶過程[21]。如圖3所示，處理壓力對包合相及非包合相中PUFA質量分數影響較小，然而施加壓力明顯促進了非包合相中PUFA得率的變化。當處理壓力小于300 MPa時，非包合相中PUFA得率隨著壓力的增大而逐步增加；而當壓力達到400 MPa時，非包合相中PUFA得率（61.57%）較300 MPa（81.81%）時降低了24.74%（P＜0.05）。故超高壓脲包法處理壓力以300 MPa為宜。

2.3 超高壓脲包法與冷凍脲包法的對比

2.2 節結果確立了超高壓脲包法富集亞麻籽油中PUFA的較優工藝：尿素/MFA質量比為3∶2且尿素-MFA與95%乙醇溶液料液比為5∶14，20 ℃冷卻后對脲包混合液施加300 MPa壓力，保壓20 min。以此料液比為基礎，同時比較4 ℃低溫脲包、－18 ℃冷凍脲包對PUFA富集效果影響。由圖4可知，超高壓脲包法所得非包合相中PUFA質量分數（96.05%）與4 ℃（95.68%）或－18 ℃（97.41%）包合18 h的效果類似，但其非包合相中PUFA得率分別提高了28.92%和41.39%，這也說明超高壓脲包法非包合相中PUFA得率的提高不止是由非包合相中PUFA質量分數下降導致，壓力在一定程度上促進了非包合相中PUFA得率的提高，且使包合時間大幅縮短，超高壓脲包法大幅提高了PUFA的分離效率。

圖1 不同結晶條件對PUFA分離效果的影響Fig.1 Effect of crystallization conditions on separation eff i ciency of PUFA

圖5 不同結晶條件下的尿素包合物晶體XRD圖譜Fig.5 XRD of urea inclusion complex crystals under different crystallization conditions

由于超高壓脲包法可達到冷凍脲包法相似的分離效果，因此將二者的包合物作晶體XRD分析，結果如圖5所示。尿素包合物晶體衍射峰對應六方晶系晶體結構[36]。冷凍與超高壓條件下出現強烈衍射峰時所在的角度相近，由Jade軟件得出冷凍條件下晶面間距分別在7.160 7、4.149 7、3.895 8、3.585 2、3.408 6、2.704 0、2.6287 ?時有強烈的衍射峰，超高壓條件下晶面間距分別在7.129 4、4.118 7、3.859 5、3.554 0、3.394 8、2.693 3、2.6206 ?時有強烈的衍射峰。兩種條件下晶體出峰的晶面間距無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 壓力對尿素包合物晶體性質的影響

2.4.1 DSC分析結果

為探究超高壓脲包過程中非包合相中PUFA得率隨壓力變化的原因，用DSC儀測試了不同壓力條件下尿素包合物晶體熱力學性質。尿素包合物晶體熔化是吸熱的過程，主要分為兩個熔化階段，第1階段是尿素包合物六方晶系晶體的熔化階段，第2階段是四方晶系尿素晶體的熔化階段[36]。在有機溶劑中，尿素包合脂肪酸時會形成六棱柱框架[37]，尿素-油酸包合物晶體屬于六方晶系，其晶體熔點為117.34 ℃[36]。圖6中DSC曲線的第1個階段峰溫均接近于六方晶系晶體的熔點，故選取不同壓力條件下的DSC曲線中第1個峰進行分析，結果如表1所示。

圖6 不同處理壓力尿素包合物DSC曲線Fig.6 DSC curves of urea inclusion complexes at different pressures

由表1可知，高壓包合晶體樣品ΔT明顯高于未經超高壓處理（0.1 MPa）樣品。經過超高壓處理后，其晶體熔融溫度范圍較未經高壓處理時更寬、峰溫更高，說明超高壓處理后晶體平均厚度較厚，且壓力從0.1 MPa上升至300 MPa時，晶體峰溫逐漸升高，說明晶體厚度隨壓力的升高而增加；400 MPa處理時峰溫降低，可能是由于壓力過大導致晶體六棱柱結構在某種程度上被破壞。超高壓處理包和物晶體ΔH較未經超高壓處理的樣品高，其中經300 MPa超高壓處理后樣品ΔH較未經超高壓處理樣品高36.68%，可知超高壓處理所得晶體中，其六方晶系的晶體熔融時吸熱較多，說明超高壓處理可在一定程度上促進尿素包合物結晶生成六方晶系晶體，從而促使非包合相中PUFA得率提高。

表1 不同處理壓力尿素包合物DSC曲線分析Table1 Thermodynamic parameters from DSC curves of ureainclusion complexes at different pressures

2.4.2 SEM觀察結果

圖7 不同處理壓力尿素包合物的SEM圖Fig.7 SEM images of urea inclusion complexes at different pressures

由圖7可以看出，未經超高壓處理時樣品的晶體形態粗細不均、長短不一，有些晶體并未形成六棱柱狀態，說明尿素并未完全包合脂肪酸，使得非包合相中PUFA質量分數較超高壓處理時低；而且其晶體分布較為松散，這可能是由于晶體生長環境不固定，導致其在抽濾過程中非包合相液體易殘存于晶體中，最終使得非包合相中PUFA得率較低。當施加100 MPa壓力時，尿素包合物晶體形態規則，呈長針柱型，能看出明顯的六棱柱晶體形貌，晶體大小分布相對0.1 MPa處理時較為均勻，說明在此條件下尿素可以相對成功地包合脂肪酸，使得非包合相中的PUFA質量分數有所增高，但晶體分布仍較為松散。當壓力增加到300 MPa時，晶體呈短針狀柱體，尿素優先選擇性包合結構簡單的飽和脂肪酸，使得PUFA較難進入尿素包合物框架，且在300 MPa處理時，晶體分布明顯比0.1、100 MPa處理時密集，在抽濾時非包合相液體不易殘存于晶體中，從而使得300 MPa處理時非包合相中PUFA得率最高。在400 MPa處理時，尿素包合物晶體呈六棱柱型，但可以看出有較多是斷裂后短小的六棱柱晶體，這可能是由于壓力過高導致包合條件較劇烈，從而使已經結合的尿素分子能量過高，當尿素晶體達到掙脫結晶體所需能量后就會從結晶體上脫離，原來成功包合脂肪酸的晶體結構被破壞，已包合的飽和脂肪酸被釋放出來，使得非包合相中PUFA得率下降。

通過對不同壓力下包合相晶體的熱力學性質和形貌比較，初步說明了超高壓作用有助于促進包合物晶體穩定，也初步解析了高壓脲包法較傳統脲包法PUFA得率提高的原因。

3 結 論

超高壓脲包法富集模擬亞麻籽油PUFA較優工藝為：尿素/MFA質量比為3∶2且尿素-MFA與95%乙醇溶液料液比為5∶14，脲包混合液在20 ℃下冷卻30 min后，采用300 MPa超高壓處理20 min，此時非包合相中PUFA質量分數為96.05%，得率為81.81%。對于模擬亞麻籽油MFA中PUFA的富集，超高壓脲包法所得非包合相中PUFA質量分數（96.05%）與低溫（95.68%）或冷凍（97.41%）脲包法分離效果類似，但得率相應分別提高28.92%和41.39%。超高壓脲包法富集亞麻籽油PUFA，其尿素包合物的晶面間距與冷凍脲包法無顯著性差異。當處理壓力小于300 MPa時，隨著壓力升高，晶體的熱力學性質趨于穩定，六方晶系晶體熔融所需能量增加，且晶體形態更規則，晶體分布更密集，這也解釋了高壓脲包法提高PUFA分離效率的原因。